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記事ID : 15212
研究用

Enzynomics社 制限酵素 ダブルダイジェストのガイドライン


背景

ダブルダイジェスト(Double digestion)

DNAクローニングは、一般的にベクターとインサートDNAを2種類の制限酵素で切断し、2つの異なる切断末端を形成します。これにより、セルフライゲーションを大幅に減少させ、クローニング効率が向上します。

Enzynomics社が提供する制限酵素の 95% 以上は、EZ-One™ バッファー中で 100% の活性を示すため、簡単にダブルダイジェストを行うことができます。EZ-One™ バッファーが付属しない制限酵素を使用する場合は、表「制限酵素の EzBuffer 中における活性/パフォーマンス」に、4種類の標準 EzBuffer 中の活性%を記載しておりますので、ご参照ください。

反応条件設定

ダブルダイジェストの反応条件設定

  • 共通の反応バッファーを用いて、2種類の制限酵素により同時にDNAを切断すると、時間と手間を省くことができます。
  • Enzynomics社の制限酵素を用いたダブルダイジェストには、EZ-One™ バッファーを使用することが可能です。EZ-One™ バッファーが付属しない制限酵素を使用する場合は、両方の制限酵素の活性が最も高くなる EzBuffer を選択してください。star 活性が問題となる場合は、EZ-CleanCut™ 制限酵素の使用を検討してください。

    [例]
    Not I および Pst I を使用してダブルダイジェストを行う場合は、どちらの酵素も EzBuffer III 中で 100% の活性を示すため、EzBuffer III を選択してください。また、どちらの酵素も Ez-One™ バッファーに対応するため、Ez-One™ バッファーを使用することも可能です。

    酵素 品番 付属するEzBuffer EzBuffer 中での活性%
    I II III IV
    Not I R001 III 0 50 100 0
    Pst I R019 III 100 100 100 75
  • 標準的なプロトコールに従い、反応条件を設定します。star 活性を最小限に抑えるために、グリセロールの終濃度を 5% 未満にしてください。例えば、50μLの反応系では、トータルの酵素量が 5 µL を超えないようにしてください。
  • 2つの酵素で至適温度が異なる場合は、最適な反応バッファーを選択し、それに応じて反応条件を設定してください。最初の酵素を添加し、最適な反応温度でインキュベートしてください。その後、最初の酵素を加熱処理により失活させてから、2番目の酵素を添加し、推奨温度でインキュベートしてください。
  • 最適な EzBuffer 以外を使用する場合には、表に示した活性%に応じて、ユニット数やインキュベーション時間を適宜変更し、切断の速度を調整することが必要となる場合があります。

    [例]
    Not I および Pvu II を使用したダブルダイジェストには、EzBuffer II を選択しますが、Not I は EzBuffer II 中における活性が 50% であるため、Pvu II の2倍のユニット数を使用することを推奨します。この場合、EzBuffer I、III、IV については、2種類の酵素のうちどちらか1つの活性が 50% 以下になるため、推奨しません。また、どちらの酵素も Ez-One™ バッファーに対応するため、Ez-One™ バッファーを使用することも可能です。

    酵素 品番 付属するEzBuffer EzBuffer 中での活性%
    I II III IV
    Not I R001 III 0 50 100 0
    Pvu II R021 II 75 100 25 10

専用バッファーでのダブルダイジェストの反応条件設定

Enzynomics社では、5種類の酵素(EcoR I、BamH I、Acc III、Bal I、Dpn II)を、それぞれ専用のバッファーで提供しています。基本的には、表「専用 EzBuffer における活性」を参照し、両方の酵素の活性が最も高くなる EzBuffer を選択してください。

Sequential Digestion の反応条件設定

2種類の酵素に最適な共通のバッファーがない場合は、DNAの消化を連続して行ってください。例えば、2種類の制限酵素の至適塩濃度が異なる場合は、まず、至適塩濃度が低い制限酵素でDNAを切断し、その後、2番目の制限酵素に最適な塩濃度になるように調整します。塩濃度を変更することにより、最初の酵素のstar 活性が予想される場合は、2番目の制限酵素で消化を行う前に、最初の酵素を熱失活させることが必要になります。最初の制限酵素の耐熱性が高い場合には、2番目の制限酵素でDNAを処理する前に、フェノール/クロロホルム抽出やDNA精製キットにより、酵素を除去することを推奨します。

制限酵素の EzBuffer 中における活性/パフォーマンス

Enzynomics社では、制限酵素の活性を最大(100%)にする、4種類の標準バッファー(EzBuffer l / II / III / lV)と、5種類の専用バッファー(EzBuffer EcoR I / BamH I / Acc III / Bal I / Dpn II)をご提供しております。バッファーは、使いやすいように色分けされています。4種類の標準 EzBuffer バッファーにおける各制限酵素の活性を下表に示します。

制限酵素 品番 配列 EzBuffer における活性% 熱失活 至適温度 希釈 メチル化
I II III IV dam dcm CpG
Aat II R026 GACGT/C 0 25 25 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Acc I R023 GT/MKAC 75 100 100 100 80℃ for 20 min. 37℃ A O O
Acc III R059 T/CCGGA 0 25 100 0 No. 65℃ B O O
Afi II R042 C/TTAAG 75 100 75 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O O
Age I R063 A/CCGGT 100 50 0 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
EZ-CleanCut™ Age I CR063 A/CCGGT 100 50 10 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Alw26 I R066 GTCTC(1/5) 75 100 50 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O
Apa I R020 GGGCC/C 100 25 0 100 65℃ for 20 min. 25℃ A O
ApaL I R041 G/TGCAC 50 100 50 100 No. 37℃ A O O
Asc I R068 GG/CGCGCC 0 0 0 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Ava I R034 C/YCGRG 25 100 100 100 80℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Ava II R040 G/GWCC 100 100 50 100 80℃ for 20 min. 37℃ A O
Avr II R071 C/CTAGG 100 50 50 100 80℃ for 20 min. 37℃ B O O O
Bal I R056 TGG/CCA 0 75 50 100 65℃ for 20 min. 37℃ B O O
BamH I R003 G/GATCC 75 100 100 100 No. 37℃ A O O O
EZ-CleanCut™ BamH I CR003 G/GATCC 100 50 10 100 No. 37℃ A O O O
Bcl I R048 T/GATCA 50 100 100 75 No. 50℃ A X O O
Bgl I R043 GCCNNNN/NGGC 75 75 100 50 65℃ for 20 min. 37℃ B O O
Bgl II R010 A/GATCT 10 75 100 10 No. 37℃ A O O O
Bsa I R072 GGTCTC(1/5) 50 100 100 100 65℃ for 20 min. 37℃ B O
BsaW I R073 W/CCGGW 50 100 100 100 80℃ for 20 min. 60℃ A O O O
BsiW I R074 C/GTACG 50 75 100 50 80℃ for 20 min. 55℃ A O O X
BsmB I R075 CGTCTC(1/5) 10 50 100 25 80℃ for 20 min. 55℃ B O O X
BsoB I R076 C/YCGRC 10 100 100 100 80℃ for 20 min. 37℃ A O O O
BsrF I R077 R/CCGGY 75 100 100 100 No. 37℃ C O O X
BstX I R030 CCANNNNN/NTGG 10 100 100 50 65℃ for 20 min. 37℃ B O O
BstY I R078 R/GATCY 50 100 75 100 80℃ for 20 min. 60℃ A O O O
BtsC I R079 GGATG(2/0) 75 100 100 100 80℃ for 20 min. 50℃ B O O O
Cfr42 I R080 CCGC/GG 100 50 25 75 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Cfr9 I R081 C/CCGGG *NR *NR 100 *NR 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Cla I R012 AT/CGAT 50 75 75 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O X
Dde I R044 C/TNAG 25 50 100 50 65℃ for 20 min. 37℃ A O O O
Dpn I R054 GA/TC 75 100 100 100 80℃ for 20 min. 37℃ B O O
Dpn II R083 /GATC 25 75 100 75 65℃ for 20 min. 37℃ B X O O
Dra I R065 TTT/AAA 75 100 50 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O O
Eco47 I R084 G/GWCC 100 100 100 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O X X
EcoO109 I R085 RG/GNCCY 50 75 100 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O
EcoR I R002 G/AATTC 50 100 75 100 65℃ for 20 min. 37℃ C O O
EZ-CleanCut™EcoR I CR002 G/AATTC 10 100 10 100 65℃ for 20 min. 37℃ C O O
EcoR V R018 GAT/ATC 0 100 100 50 65℃ for 20 min. 37℃ A O O
EZ-CleanCut™EcoR V CR018 GAT/ATC 25 100 100 100 65℃ for 20 min. 37℃ B O O
EcoT38 I R087 GRGCY/C 75 100 0 100 65℃ for 30 min. 37℃ A O O O
Fok I R088 GGATG(9/13) 100 100 10 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O
Fsp I R089 TGC/GCA 75 100 50 100 65℃ for 20 min. 37℃ C O O X
Hae II R090 RGCGC/Y 10 100 100 100 80℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Hae III R022 GG/CC 50 100 75 100 80℃ for 20 min. 37℃ A O O O
Hga I R052 GACGC(5/10) 100 75 10 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Hha I R045 GCG/C 10 100 100 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Hinc II R037 GTY/RAC 75 50 50 100 65℃ for 20 min. 37℃ B O O
Hind II R091 GTY/RAC 100 100 50 100 65℃ for 15 min. 37℃ A O O X
Hind III R008 A/AGCTT 25 100 75 100 80℃ for 20 min. 37℃ B O O O
Hinf I R046 G/ANTC 50 100 100 100 80℃ for 20 min. 37℃ A O O
HinP1 I R061 G/CGC 50 100 100 75 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Hpa I R031 GTT/AAC 0 50 25 100 No. 37℃ A O O
Hpa II R049 C/CGG 100 75 50 100 80℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Hph I R053 GGTGA(8/7) 100 75 10 100 65℃ for 20 min. 37℃ B O O
Hpy188 I R092 TCN/GA 50 75 50 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O
Hpy99 I R093 CGWCG/ 100 25 10 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
HpyCH4 V R094 TG/CA 75 100 25 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O O
Kpn I R014 GGTAC/C 100 50 0 100 No. 37℃ A O O O
EZ-CleanCut™ Kpn I CR014 GGTAC/C 100 25 10 100 No. 37℃ A O O O
Mbo I R050 /GATC 75 100 100 100 65℃ for 20 min. 37℃ A X O
Mbo II R060 GAAGA(8/7) 100 100 50 100 65℃ for 20 min. 37℃ C O O
Mlu I R032 A/CGCGT 25 75 100 50 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Mnl I R055 CCTC(7/6) 75 100 75 100 65℃ for 20 min. 37℃ B O O O
Mse I R062 T/TAA 75 100 100 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O O
Msp I R057 C/CGG 75 100 75 100 No. 37℃ A O O O
MspA1 R058 CMG/CKG 0 100 75 100 65℃ for 20 min. 37℃ B O O
Nae I R035 GCC/GGC 100 100 25 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Nar I R024 GG/CGCC 25 100 50 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Nco I R004 C/CATGG 50 100 100 75 65℃ for 20 min. 37℃ A O O O
EZ-CleanCut™ Nco I CR004 C/CATGG 50 100 10 100 80℃ for 20 min. 37℃ B O O O
Nde I R006 CA/TATG 75 100 100 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O O
NgoM IV R095 G/CCGGC 25 75 0 100 80℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Nhe I R016 G/CTAGC 100 100 10 100 65℃ for 20 min. 37℃ C O O
EZ-CleanCut™ Nhe I CR016 G/CTAGC 100 25 10 100 80℃ for 20 min. 37℃ C O O
Nla IV R096 GGN/NCC 0 10 10 100 65℃ for 20 min. 37℃ B O
Not I R001 GC/GGCCGC 0 50 100 0 65℃ for 20 min. 37℃ C O O X
EZ-CleanCut™ Not I CR001 GC/GGCCGC 50 100 100 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Nru I R029 TCG/CGA 0 50 100 75 65℃ for 20 min. 37℃ A O X
Nt.BstNB R097 GAGTC(4/-5) 0 10 100 0 80℃ for 20 min. 55℃ A O O O
Ple I R098 GAGTC(4/5) 75 75 50 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O
PspG I R099 /CCWGG 25 100 75 100 No. 37℃ A O X O
Pst I R019 CTGCA/G 100 100 100 75 80℃ for 20 min. 37℃ C O O O
Pvu I R100 CGAT/CG 25 75 100 50 No. 37℃ B O O X
Pvu II R021 CAG/CTG 75 100 25 10 No. 37℃ B O O O
EZ-CleanCut Pvu II CR021 CAG/CTG 10 10 10 100 No. 37℃ B O O O
Rsa I R047 GT/AC 100 100 75 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O
Sac I R005 GAGCT/C 100 75 25 75 65℃ for 20 min. 37℃ A O O O
EZ-CleanCut™ Sac I CR005 GAGCT/C 75 50 10 100 65℃ for 20 min.   A O O O
Sac II R036 CCGC/GG 50 100 50 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Sal I R009 G/TCGAC 0 0 100 0 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
EZ-CleanCut™ Sal I CR009 G/TCGAC 10 100 100 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Sau96 I R101 G/GNCC 50 100 100 100 80℃ for 20 min. 37℃ A O
Sca I R028 AGT/ACT *NR *NR 100 *NR 80℃ for 20 min. 37℃ A O O O
EZ-CleanCut™Sca I CR028 AGT/ACT 100 100 10 100 80℃ for 20 min. 37℃ B O O O
Sda I R102 CCTGA/GG 75 75 0 100 80℃ for 20 min. 37℃ A O O O
Sfi I R033 GGCC(4/1)GGCC 25 100 25 100 No. 50℃ C O
SgrA I R103 CR/CCGGYG 100 100 0 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Sma I R015 CCC/GGG 0 0 0 100 65℃ for 20 min. 25℃ A O O X
SnaB I R027 TAC/GTA 100 75 25 100 80℃ for 20 min. 37℃ A O O X
Spe I R011 A/CTAGT 50 100 75 100 80℃ for 20 min. 37℃ C O O O
Sph I R017 GCATG/C 50 100 50 75 65℃ for 20 min. 37℃ B O O O
EZ-CleanCut™ Sph I CR017 GCATG/C 50 25 10 100 65℃ for 20 min. 37℃ B O O O
Sse9 I R104 /AATT 100 50 50 75 65℃ for 20 min. 55℃ A O O O
Ssp I R105 AAT/ATT 50 100 25 100 65℃ for 20 min. 37℃ B O O O
EZ-CleanCut™Ssp I CR105 AAT/ATT 25 100 10 100 65℃ for 20 min. 37℃ B O O O
Stu I R025 AGG/CCT 75 100 75 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O
Swa I R039 ATTT/AAAT 75 75 100 25 65℃ for 20 min. 25℃ B O O O
Taq I R051 T/CGA 50 100 100 100 80℃ for 20 min. 65℃ B O O
Tth111 I R038 GACN/NNGTC 25 100 100 100 No. 65℃ B O O O
Xba I R013 T/CTAGA 0 100 100 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O
Xho I R007 C/TCGAG 50 100 100 100 80℃ for 20 min. 37℃ A O O
Xma I R064 C/CCGGG 50 75 25 100 65℃ for 20 min. 37℃ A O O
*NR: 非推奨
O 影響なし
X 影響あり
配列条件により影響あり
Ezbuffer(1X) 組成
EzBuffer 品番 組成
EzBuffer l RB001、黄色 10 mM Bis Tris Propane-HCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/ml BSA (pH 7.0 @25℃)
EzBuffer ll RB002、緑色 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 100 μg/ml BSA (pH 7.9 @25℃)
EzBuffer lll RB003、赤色 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 100 μg/ml BSA (pH 7.9 @25℃)
EzBuffer lV RB004、青色 20 mM Tris-酢酸、10 mM 酢酸マグネシウム、50 mM 酢酸カリウム、100 μg/ml BSA (pH 7.9 @25℃)
EzDiluent バッファー(1X)組成
EzDiluent
バッファー
品番 組成
EzDiluent A DB001 10 mM Tris-HCl, 50mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM ジチオスレイトール, 200μg/ml BSA, 50% グリセロール (pH 7.4 @25℃)
EzDiluent B DB002 10 mM Tris-HCl, 300mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM ジチオスレイトール, 500μg/ml BSA, 50% グリセロール (pH 7.4 @25℃)
EzDiluent C DB003 10 mM Tris-HCl, 250mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM ジチオスレイトール, 0.15% Triton X-100, 200 μg/ml BSA, 50% グリセロール (pH 7.4 @25℃)

専用 EzBuffer における活性

数種類の制限酵素(EcoR I、BamH I、Acc III、Bal I、Dpn II)は、最大の活性を得るために、専用のバッファーが必要になります。

ダブルダイジェストの際に、ご使用になる制限酵素が専用バッファーを必要とする場合は、下表をご参照ください。5種類の専用 EzBuffer バッファーにおける、一般的な制限酵素の活性(%)を記載しました。4種類の標準バッファーのいずれかで活性を示す制限酵素は、専用バッファー中でも通常は活性を示します。したがって、専用バッファー中でもダブルダイジェストを行うことが可能です。最適なバッファー以外を使用することで、切断効率が低下する場合は、制限酵素の量を増やすか、反応時間を延長してください。下表に示した活性(%)は概算で、使用した基質の量は活性ユニットの決定に使用する量に準じます。

制限酵素 品番 EzBuffer 中での活性%
EcoR I
Buffer
BamH I
Buffer
Acc III
Buffer
Bal I
Buffer
Dpn II
Buffer
Aat II R026 0 0 0 0 0
Acc I R023 100 75 100 75 50
Acc III R059 100 50 100 0 0
Afi II R042 50 50 75 100 75
Age I R063 0 0 0 75 0
Alw26 I R066 50 50 75 75 50
Apa I R020 0 0 0 75 0
ApaL I R041 75 25 50 100 0
Asc I R068 0 0 0 0 0
Ava I R034 100 50 75 75 25
Ava II R040 75 25 50 100 75
Avr II R071 50 50 50 50 100
Bal I R056 0 50 50 100 0
BamH I R003 100 100 100 75 50
Bcl I R048 100 75 100 50 50
Bgl II R043 100 100 100 10 100
Bgl I R010 100 100 100 0 25
Bsa I R072 100 50 75 50 50
BsaW I R073 75 75 100 10 50
BsiW I R074 100 100 100 50 100
BsmB I R075 100 100 75 0 25
BsoB I R076 100 75 100 25 0
BsrF I R077 100 50 100 75 75
BstX I R030 100 100 100 10 25
BstY I R078 75 50 75 100 0
BtsC I R079 100 75 100 100 50
Cfr42 I R080 25 25 25 25 50
Cfr9 I R081 100 100 100 NR 100
Cla I R012 100 100 75 50 50
Dde I R044 100 50 75 50 25
Dpn I R054 100 100 100 50 100
Dpn II R083 100 100 100 50 100
Dra I R065 100 50 50 75 10
Eco47 I R084 100 100 100 100 100
EcoO109 I R085 100 50 75 75 25
EcoR I R002 100 50 50 75 75
EcoR V R018 100 50 75 0 50
EcoT38 I R087 0 100 0 75 0
Fok I R088 10 10 50 100 10
Fsp I R089 75 10 25 25 10
Hae II R090 75 25 75 50 10
Hae III R022 100 100 50 100 50
Hga I R052 75 10 10 100 50
Hha I R045 100 100 100 100 10
Hinc II R037 50 100 50 25 100
Hind II R091 50 75 75 50 100
Hind III R008 75 25 75 50 0
Hinf I R046 100 100 100 50 50
HinP1 I R061 100 100 100 100 25
Hpa I R031 100 50 25 25 25
Hpa II R049 50 50 50 75 25
Hph I R053 50 10 50 100 50
Hpy188 I R092 50 50 50 100 25
Hpy99 I R093 10 50 10 50 100
HpyCH4 V R094 75 25 75 100 50
Kpn I R014 0 0 0 75 0
Mbo I R050 100 75 100 100 25
Mbo II R060 50 75 75 100 75
Mlu I R032 100 100 100 50 50
Mnl I R055 75 50 75 100 75
Mse I R062 100 50 75 50 0
Msp I R057 75 50 75 100 50
MspA1 R058 50 0 25 25 0
Nae I R035 25 25 25 100 25
Nar I R024 50 0 50 100 0
Nco I R004 100 75 100 100 100
Nde I R006 100 100 100 50 100
NgoM IV R095 10 0 10 100 0
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Nla IV R096 10 10 10 0 10
Not I R001 100 50 0 75 0
Nru I R029 75 75 75 25 0
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Pvu II R021 50 25 25 75 0
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Sac I R005 75 25 25 25 25
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Sal I R009 100 100 75 0 75
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Ssp I R105 75 50 75 75 50
Stu I R025 75 25 75 75 50
Swa I R039 75 100 100 25 100
Taq I R051 100 100 100 50 50
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Xho I R007 100 75 100 50 25
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