Enzynomics（EZN）社　制限酵素 ダブルダイジェストのガイドライン

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ダブルダイジェスト（Double digestion）

DNAクローニングは、一般的にベクターとインサートDNAを2種類の制限酵素で切断し、2つの異なる切断末端を形成します。これにより、セルフライゲーションを大幅に減少させ、クローニング効率が向上します。

Enzynomics社が提供する制限酵素の 95% 以上は、EZ-One™ バッファー中で 100% の活性を示すため、簡単にダブルダイジェストを行うことができます。EZ-One™ バッファーが付属しない制限酵素を使用する場合は、表「制限酵素の EzBuffer 中における活性／パフォーマンス」に、4種類の標準 EzBuffer 中の活性％を記載しておりますので、ご参照ください。

ダブルダイジェストの反応条件設定

• 共通の反応バッファーを用いて、2種類の制限酵素により同時にDNAを切断すると、時間と手間を省くことができます。
• Enzynomics社の制限酵素を用いたダブルダイジェストには、EZ-One™ バッファーを使用することが可能です。EZ-One™ バッファーが付属しない制限酵素を使用する場合は、両方の制限酵素の活性が最も高くなる EzBuffer を選択してください。star 活性が問題となる場合は、EZ-CleanCut™ 制限酵素の使用を検討してください。

  ［例］
  Not I および Pst I を使用してダブルダイジェストを行う場合は、どちらの酵素も EzBuffer III 中で 100% の活性を示すため、EzBuffer III を選択してください。また、どちらの酵素も Ez-One™ バッファーに対応するため、Ez-One™ バッファーを使用することも可能です。

  酵素	品番	付属するEzBuffer	EzBuffer 中での活性％
  			I	II	III	IV
  Not I	R001	III	0	50	100	0
  Pst I	R019	III	100	100	100	75

• 標準的なプロトコールに従い、反応条件を設定します。star 活性を最小限に抑えるために、グリセロールの終濃度を 5% 未満にしてください。例えば、50μLの反応系では、トータルの酵素量が 5 µL を超えないようにしてください。
• 2つの酵素で至適温度が異なる場合は、最適な反応バッファーを選択し、それに応じて反応条件を設定してください。最初の酵素を添加し、最適な反応温度でインキュベートしてください。その後、最初の酵素を加熱処理により失活させてから、2番目の酵素を添加し、推奨温度でインキュベートしてください。
• 最適な EzBuffer 以外を使用する場合には、表に示した活性％に応じて、ユニット数やインキュベーション時間を適宜変更し、切断の速度を調整することが必要となる場合があります。

  ［例］
  Not I および Pvu II を使用したダブルダイジェストには、EzBuffer II を選択しますが、Not I は EzBuffer II 中における活性が 50% であるため、Pvu II の2倍のユニット数を使用することを推奨します。この場合、EzBuffer I、III、IV については、2種類の酵素のうちどちらか1つの活性が 50% 以下になるため、推奨しません。また、どちらの酵素も Ez-One™ バッファーに対応するため、Ez-One™ バッファーを使用することも可能です。

  酵素	品番	付属するEzBuffer	EzBuffer 中での活性％
  			I	II	III	IV
  Not I	R001	III	0	50	100	0
  Pvu II	R021	II	75	100	25	10

専用バッファーでのダブルダイジェストの反応条件設定

Enzynomics社では、5種類の酵素（EcoR I、BamH I、Acc III、Bal I、Dpn II）を、それぞれ専用のバッファーで提供しています。基本的には、表「専用 EzBuffer における活性」を参照し、両方の酵素の活性が最も高くなる EzBuffer を選択してください。

Sequential Digestion の反応条件設定

2種類の酵素に最適な共通のバッファーがない場合は、DNAの消化を連続して行ってください。例えば、2種類の制限酵素の至適塩濃度が異なる場合は、まず、至適塩濃度が低い制限酵素でDNAを切断し、その後、2番目の制限酵素に最適な塩濃度になるように調整します。塩濃度を変更することにより、最初の酵素のstar 活性が予想される場合は、2番目の制限酵素で消化を行う前に、最初の酵素を熱失活させることが必要になります。最初の制限酵素の耐熱性が高い場合には、2番目の制限酵素でDNAを処理する前に、フェノール／クロロホルム抽出やDNA精製キットにより、酵素を除去することを推奨します。

Enzynomics社では、制限酵素の活性を最大（100%）にする、4種類の標準バッファー（EzBuffer l / II / III / lV）と、5種類の専用バッファー（EzBuffer EcoR I / BamH I / Acc III / Bal I / Dpn II）をご提供しております。バッファーは、使いやすいように色分けされています。4種類の標準 EzBuffer バッファーにおける各制限酵素の活性を下表に示します。

数種類の制限酵素（EcoR I、BamH I、Acc III、Bal I、Dpn II）は、最大の活性を得るために、専用のバッファーが必要になります。

ダブルダイジェストの際に、ご使用になる制限酵素が専用バッファーを必要とする場合は、下表をご参照ください。5種類の専用 EzBuffer バッファーにおける、一般的な制限酵素の活性（%）を記載しました。4種類の標準バッファーのいずれかで活性を示す制限酵素は、専用バッファー中でも通常は活性を示します。したがって、専用バッファー中でもダブルダイジェストを行うことが可能です。最適なバッファー以外を使用することで、切断効率が低下する場合は、制限酵素の量を増やすか、反応時間を延長してください。下表に示した活性（%）は概算で、使用した基質の量は活性ユニットの決定に使用する量に準じます。