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記事ID : 14191
研究用

FD Rapid GolgiStain™ Kit を用いたゴルジ染色プロトコール

ゴルジ染色 プロトコール


  商品詳細  「FD Rapid GolgiStain™ Kit」

対象商品: PK401

参照元マニュアル: FD Rapid GolgiStain™ Kit (large) Manual

GolgiStain™ キット構成内容 & 必要な機器・器材

FD Rapid GolgiStain™ キット(品番:PK401) 構成内容

  • 溶液 A 250 mL
  • 溶液 B 250 mL
  • 溶液 C 250 mL x 2
  • 溶液 D 250 mL
  • 溶液 E 250 mL
  • ガラスレトーリバー 2
  • 天然毛 絵筆
  • 滴下ボトル
  • プラスチックピンセット
  • マニュアル

その他必要な試薬・機器・器材

  1. 蒸留水 または Milli-Q 水
  2. プラスチック/ガラス製チューブまたはバイアル
  3. 必要な機器・器材
    • ゼラチンコート顕微鏡スライド (Cat. #PO101)
    • カバースリップ
    • 染色瓶
    • エタノール
    • キシレン
    • Permount®
    • 光学顕微鏡

Permount® is a registered trademark of Fisher Scientific.

ゴルジ染色プロトコール

組織の準備

操作前の注意事項 )

  • 使用するすべての容器(プラスチックが好ましい)は、清潔で蒸留水でリンスしたものをご使用ください。
  • 溶液Aおよび溶液Bの存在下では、金属製の用具は使用しないでください。
  • 容器は、しっかりと閉じた状態で保管してください。
  • 溶液Aと溶液Bで処理した組織(切片を含む)は、可能な限り遮光条件で保管してください。
  • 以下の操作は、特別に記載がなければ、室温で行ってください。

プロトコール

  1. 実験動物は、組織摘出前に深く麻酔してください。動物の脳(またはヒト脳検体)はできるだけ迅速に頭蓋から除去される必要がありますが、組織の損傷や押しつぶしを避けて慎重に操作を行ってください。
    Note:
    • 動物の潅流は必要のない限り避けてください。動物を灌流する必要がある場合(5分未満、4 %パラホルムアルデヒド)、組織のポストフィックス(postfix)を行わないでください。
    • ラットの脳などの大きい脳標本は、約10mmの厚さのブロックに鋭利な刃でスライスしてください。 重要!
  2. 表面の血液を除去するために、蒸留水中またはMilli-Q 水中でリンスします。
  3. 溶液Aと溶液Bの等量を混合して浸透液を調製します。
    調製した浸透液に組織を浸し、暗所で2週間、室温で保存します*。なお、浸透液は、最初の6時間後または翌日に交換してください。
    *ほとんどの場合、2週間の浸透で良好な結果を得られますが、組織のサイズや種類によっては最適化が必要です。多くの組織で、浸透時間は3週間までで十分であると考えられます。一方、浸透時間の延長によって、染色バックグラウンドが高くなる場合がありますので注意してください。
    Note:
    • 溶液AとBの混合溶液は、少なくとも使用する24時間前に調製し、攪拌せず保管してください。
    • 沈殿物を含まない溶液の上部を使用することが重要です。
    • 使用前の浸透溶液は、暗所で1ヶ月間 室温で保存できます。浸透溶液は、1cm3の組織あたり、最低 5 ml 使用します。浸透溶液が少ない場合、染色の感度および信頼性を低下させますので注意してください。
    • 良好な結果を得るには、浸透期間中の週2回、組織の容器を静かに(振らないでください)横方向へと数秒旋回させてください。
    注意)
    溶液Aと溶液Bは、塩化水銀、二クロム酸カリウムカリウム、クロム酸カリウムを含有します。これらの溶液は、皮膚に接触すると有毒であり、飲み込むと非常に危険です。実験は、ドラフト内で行い、操作中は適切な防護服、手袋および眼や顔の保護具を着用してください。
  4. 溶液Cに組織を移し、暗所・室温で、最低72時間(最大で1週間)保管します。なお、溶液は、最初の24時間後、または翌日に少なくとも一度交換してください。
  5. 切片作製は、-20℃から-22℃でクライオスタット(cryostat)を用いて行うことで、100μm厚から200μm厚の良好な切片を作製できます。(切片作製前にデータシート 10ページ を良くお読みください). ビブラトーム(vibratome)やスライディングミクロトーム(sliding microtome)を含む他のタイプのミクロトームも使用することができます。 (データシートの10ページ、11ページをご参照ください。).
    次に、各切片をガラス試料レトリーバー(キット付属品)で移動し、ゼラチンコーティング顕微鏡スライド(品番:PO101)に溶液C を滴下してマウントします。(溶液Cをスライド上に簡単に滴下するための滴下ボトルが付属しています。)スライド上の余剰の溶液は、パスツールピペットで吸引した後、濾紙のストリップで吸収して取り除きます。その後、切片を室温で自然乾燥させます。(ファンやホットプレートを使用しないでください)。切片はできるだけ早く処理するのが最適ですが、最大3日間であれば、暗所・室温でスライドボックスに保管できます。

染色手順

操作前の注意事項 )

  • 染色中およびカバーガラスをかける前の間、切片を乾燥させないでください。
  1. 切片を蒸留水または Milli-Q 水にて各4分ずつ2回 リンスしてください。
  2. 切片を、溶液D:溶液E:蒸留水=1:1:2 の混合液に移して、10分間浸漬してください。
  3. 例)
    • ・溶液 D 10 ml
    • ・溶液 E 10 ml
    • ・蒸留水 20 ml
    Note:
    • ワーキング溶液は、使用直前に調製してください。 また、切片のサイズにも依存しますが、100ml につき最大100 セクション(例、マウス脳)分に使用できます。
    • ワーキング溶液を含むボトルおよび染色瓶は、試薬の蒸発を防ぐために蓋をしてください。
    • 良好な結果を得るには、ワーキング溶液をインキュベーション中、頻繁に攪拌する必要があります。
  4. 切片を蒸留水または Milli-Q 水で各4分ずつ2回リンスします。(蒸留水は頻繁に交換する必要があります)
  5. (optional step)必要に応じて、クレシルバイオレット(cresyl violet)やチオニン( thionin)で対比染色を行います。
  6. Note:
    • 対比染色を行うには、ステップ3 の時間を延長してください。各4分・2回の洗浄を、各5分・4回かそれ以上行ってください。
  7. 50%、75%および95%エタノールで4分ずつ、切片を脱水します(各ステップをスキップせず必ず行ってください)。
  8. 切片を、無水エタノールで各4分ずつ4回脱水します。(脱水の時間は延長しないでください) ?。
  9. キシレンで、各4分ずつ3回、透徹後、Permount® でカバースリップをかけます。
    Note:
    • 切片は、カバースリップをかける前に数時間キシレン中で保存することができます。
    • 最良の結果を得るには、希釈されていない Permount®を使用してください。
    • ゴルジ染色後の切片は、可能な限り遮光条件で保管してください。
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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては
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