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記事ID : 5787

セダレーン社 Lympholyte® リンパ球分離 推奨プロトコール


リンパ球分離培地 ヒトリンパ球の場合

【商品情報】 ヒトリンパ球分離性溶液 Lympholyte®-H
(品番CL5010(5×30mL),CL5015(1×100mL),CL5020(1×500mL))

1 商品

Lympholyte®-Hは,ヒト末梢血から生リンパ球および単球を分離するために設計された,密度勾配分離媒体です。

2 適用

Lympholyte®-Hは単純な手法で,ヒト血液から赤血球及び死細胞を除去することができます。また,Lympholyte®-Hは,大多数の顆粒球(好中球を含む)を除去することができます。結果として,高率で非選択的な生リンパ球と単球を得ることができます。

3 形状

滅菌済溶液。0.22μmフィルターで濾過されています。

4 貯蔵・安定性

未開封時は室温(22℃±3℃),開封後は4℃にて保存してください。常に遮光してください。表示された有効期限前に使用してください。

注意:長期間の保存は相の分離につながるおそれがあります。

使用前によく振ってください。気泡が消えるまで(2-3分)立てておいてください。密度は温度の影響を受けますので,室温にて使用してください。

5 仕様

構成:5.64% ポリシュークロース 400,9.65% Sodium Diatrizoate

密度:1.0770 + 0.001g/cm3(22℃)

pH:6.9±0.3
生存度/純度:生リンパ球の回収率≧70%(個体差があるかもしれません)
赤血球のコンタミネーション≦10%

6 使用方法

Lympholyte®-Hとお好みの無血清培地(PBS,Modified McCoy's Medium等)を室温(約22℃)で,無菌的な方法で使用してください。

1. ヒト血液を,抗凝固剤を含んだチューブに採取するか,フィブリン除去された血液を使用してください。

2. 血液を等量の培地に溶解してください。

3. 方法AかBに従って(図参照),溶解した血液6mLを,Lympholyte®-H 3mLに重層してください。10-15mL遠心チューブを使用してください。

方法A:Lympholyte®-H 3mLを遠心チューブに入れてください。ピペットを使用し,界面をできるだけ乱さないようにして,溶解した血液6mLを重層してください(図A)。Lympholyte®-Hは細胞懸濁液よりも密度が高いため,明確な境界が形成されます(図C)。

方法B:溶解した血液6mLを遠心チューブに入れてください。長い(23cm)パスツールピペットを,チューブの底に設置してください。Lympholyte®-H 3mLを,パスツールピペットを通して,ゆっくりと,溶解した血液の下に重層されるように加えてください。細胞懸濁液の下にLympholyte®-H 3mLが重層されるまで続けてください。Lympholyte®-Hは細胞懸濁液よりも密度が高いため,明確な境界が形成されます(図C)。

4. 室温,20分,800×gにて遠心分離を行ってください。

5. 遠心後,境界に明確なリンパ球層が現れます(図D)。これを,パスツールピペットを用いて慎重に除去し,新たな遠心チューブに移してください。

6. 溶液の密度を減らすために,移した細胞を培地に溶解してください。リンパ球をペレットにするために800×g,10分間遠心し,その後上清を捨ててください。

注意:必要があれば,この段階で血小板を除去します。

A. バッファー0.5mLとトロンビン50μLを加え,穏やかにペレットを再溶解します。

B. バッファーを加えて10mLに調整し,十分に混和します。

C. 細胞を,ゆっくりと(100rpm)3分間遠心します。血小板は凝集し,底に沈みます。

D. 凝集した血小板を残し,細胞を含む上清を取り除いて別のチューブに移します。

あるいは,

A. 800rpm,1分間遠心し,細胞をペレットにします。

B. 上清を取り除き,細胞をバッファーに再溶解します。

C. この操作を2回繰り返します。血小板が除去されるにつれ,上清はより透明になります。

7. 次の操作の前に,リンパ球を培地で2〜3回洗います。(この段階では血清を含む培地も使用できます)

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リンパ球分離培地 ラットリンパ球の場合

【商品情報】 ラットリンパ球分離溶液 Lympholyte®-Rat
(品番CL5040(5×30mL),CL5045(1×500mL),CL5041(1×100mL))

1 説明

Lympholyte®-Ratは,ラットリンパ球懸濁液から生リンパ球を分離するために設計された,密度勾配分離媒体です。

2 適用

Lympholyte®-Ratは,単純な手法で,ラット脾臓,リンパ節,胸腺及び骨髄液から,赤血球,死細胞及び細胞片を除去することができます。結果として,細胞集団は,細胞毒性試験標的細胞,FACSのようなin vivo,in vitroでの機能研究に適した,高率で非選択的な生リンパ球で構成されます。

3 その他の成功例

i)経時的細胞毒性試験での死細胞の除去。(例:B細胞欠乏)

ii)肝臓,肺を含む,その他のラット組織溶解物からの,赤血球,死細胞および細胞片の除去。

iii)さまざまなクローン細胞やハイブリドーマセルラインからの,生細胞の収集と死細胞および細胞片の除去。

4 貯蔵・安定性

未開封時は室温,開封後は4℃にて保存してください。常に遮光してください。

注意:長期間の保存は相の分離につながるおそれがあります。

使用前によく振ってください。気泡が消えるまで立てておいてください。室温にて使用してください。

5 仕様

構成:Nycograde™ポリシュークロース400,Sodium Diatrizoate

密度:1.094+0.001g/cm3(22℃)

pH:6.9±0.3

生存度/純度:生リンパ球の回収率≧70%

6 ラット脾臓懸濁液における結果

フラクション                       生リンパ球   赤血球のコンタミネーション

上層                               <1%          0

中間層                            >70%        <15%

下層                               <10%        <5%

ペレット                            <20%        >80%

7 使用方法

Lympholyte®-Ratとお好みの無血清培地(PBS,Modified McCoy's Medium等)を室温(約22℃)で使用してください。

1. お好みの手法とメディウムに合わせて,リンパ球懸濁液を準備してください。尚,脾臓は,膜含有量が高いため,分離操作の前に懸濁液をきれいにすることが求められます。

推奨方法 a)脾臓を細かく切る

b)ホモジナイズ

c)スクリーンメッシュを通す

他の組織:透明な懸濁液が得られるよう,完全にホモジナイズする。

2. 細胞濃度を,有核細胞2×107 個/mLかそれ以下になるよう,調整してください。

注:もし細胞懸濁液が多量の細胞片や赤血球を含むなら,細胞濃度を1.0×107 個/mLにするために分離操作をしてください。

3. 方法AあるいはBのようにして,細胞懸濁液をLympholyte®-Ratに重層してください。10-15mL遠心チューブを使用してください。

方法A:Lympholyte®-Rat 5mLを遠心チューブに入れてください。ピペットを使用し,界面をできるだけ乱さないようにして,細胞懸濁液5mLを重層してください。(図A)Lympholyte®-Ratの方が細胞懸濁液よりも密度が高いため,明確な境界が現れます(図C)。

方法B:細胞懸濁液5mLを遠心チューブに入れてください。長い(23cm)パスツールピペットを,チューブの底に設置してください。Lympholyte®-Ratを,パスツールピペットを通して,ゆっくりと,細胞懸濁液の下に重層されるように加えてください。細胞懸濁液の下にLympholyte®-Rat 5mLが重層されるまで続けてください。Lympholyte®-Ratは細胞懸濁液よりも密度が高いため,明確な境界が形成されます(図C)。

4. 室温,20分,1000-1500Gにて遠心分離を行ってください。

5. 遠心後,境界に明確なリンパ球層が現れます(図D)。これを,パスツールピペットを用いて慎重に除去し,新たな遠心チューブに移してください。

6. 溶液の密度を減らすために,移した細胞を培地に溶解してください。リンパ球をペレットにするために800G,10分間遠心し,その後上清を捨ててください。

7. 次の操作の前に,リンパ球を培地で2〜3回洗います。(この段階では血清を含む培地も使用できます)

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参考文献:
1. Kawashima,H.,et al. 1994,Journal of Immunology. 153:1982.

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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては
使用しないように、十分ご注意ください。