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記事ID : 5152

霊長類ES細胞用凍結保存液 使用方法


凍結方法

凍結を行う前に
高い生存率を得るためには、細胞を凍結保存液に懸濁後、液体窒素により急速凍結させることが重要です。凍結保存液への懸濁から凍結までに長時間要すると細 胞生存率が極端に低下する原因になります。操作をスムーズに進めるために、完全に準備が整っていることを確認してから開始して下さい。貴重なサンプルを凍 結解凍される場合は、操作に十分慣れてから行われることをお勧めします。

必要なもの

  • コンフルエント状態の霊長類ES細胞 35mmから100mmディッシュサイズの場合、各1枚から凍結チューブ1本へ凍結可能です。
  • 霊長類ES細胞用培地(品番:RCHEMD001) 使用前に室温にもどします。製品添付のデータシートを十分にお読みください。
  • 霊長類ES細胞用細胞剥離液(品番:RCHETP001) 使用前に室温にもどします。製品添付のデータシートを十分にお読みください。
  • PBS(−)
  • 15mL遠心チューブ
  • 液体窒素
  • ピンセット 液体窒素につけても大丈夫なものをご用意ください。
  • P-1000 ピペットマン及び滅菌済みチップ
  • 1mL凍結チューブ
  • 凍結チューブたて
  • その他培養操作に必要なもの

 

操作方法(60mmディッシュ1枚の場合)

  1. 必要なものを準備します。
    • 凍結チューブをあらかじめ氷上で冷やします。 このとき、チューブのラベルに必要事項(例;細胞名,継代数,日付等)
    • 液体窒素をクリーンベンチの側に起きます。 細胞を凍結液に懸濁後、液体窒素中で凍結が完了するまでの時間が、凍結解凍後の細胞生存率へ大きく影響してきます。そのため、液体窒素中へ細胞をつけるまでの時間を短くする(15秒以内)ことが重要です。
    • クリーンベンチ内を準備します。 15mL遠心チューブ、凍結チューブ立て、ピンセット、P-1000ピペットマン及び滅菌済みチップを使いやすいところに配置します。P-1000ピペットマンは、あらかじめ200μLにセットしておきます。
  2. コンフルエント状態のES細胞を準備します。
  3. 培地を除き、PBS(-) 2-3mLで1回、細胞を洗浄します。
  4. 細胞剥離液を1mL添加し、細胞表面全体に行き渡らせた後、37℃のCO2インキュベーターでインキュベートします。
  5. 霊長類ES細胞用培地を2-3mL添加し、コロニーを塊のまま剥がします 注1
  6. 細胞懸濁液を15mL遠心チューブに回収します。ディッシュに細胞が残っているようなら、もう一度新しい培地を加えて残りの細胞を回収します。
  7. 約170×g (1,000rpm)、4℃で3分間遠心します。
  8. サンプルが数本ある場合、遠心後氷冷しておきます。 (以下の操作は、1サンプルずつ行うようにしてください。)
  9. 上清をできるだけ取り除きます 注2
  10. あらかじめ氷冷しておいた凍結チューブ1本を、クリーンベンチ内に用意します。
  11. P-1000ピペットマンで、凍結保存液を200μL量りとります 注3
  12. 細胞を凍結保存液に懸濁後、凍結チューブへ移します。すばやく蓋を閉めてピンセットで凍結チューブを保持し、チューブの底部から2/3までを液体窒素に浸します。(この操作を手早く行うことが、凍結保存を成功させるために非常に重要です。15秒以内を目安に作業を完了させてください。)注4
  13. 液体窒素中で十分に冷却し、内部まで完全に凍結します。その後、液体窒素タンクもしくは-135℃以下のフリーザーに移します。

 

注1 凍結解凍の作業過程で、コロニーは自然にほぐれるため、ここでコロニーをくずす必要はありません。

注2 上清が残っていると凍結保存液が希釈されるため、凍結解凍後の細胞生存率低下の原因になることがあります。

注3 凍結する細胞数にかかわらず、凍結保存液は凍結チューブ1本あたり200μLで凍結可能です。

注4 細胞を凍結液に懸濁する際は、2-3回のピペッティングで充分です。それ以上の操作は生存率低下の原因になります。

解凍方法

解凍を行う前に
あらかじめ十分にあたためた培地で細胞を懸濁することで急速に解凍を行います。この操作に時間をかけると生存率低下の原因になります。1回の操作で凍結チューブ1本ずつ行うようにして下さい。ウオーターバスでの解凍は細胞生存率を極端に低下させる原因になりますので、行わないで下さい。

必要なもの

  • 凍結培地
  • 霊長類ES細胞用培地 あらかじめ必要量を37℃ウォーターバスで温めておきます。
  • 15mL遠心チューブ
  • フィーダー細胞 ディッシュサイズは、凍結時と同じものをご用意ください。
  • 液体窒素もしくはドライアイス
  • その他培養操作に必要なもの

 

操作方法

  1. あらかじめ、15mL遠心チューブに培地を10mL加え、37℃ウォーターバスで温めておきます。
  2. 温めた培地をクリーンベンチ内に準備します。凍結細胞を液体窒素もしくはフリーザーから出したら、液体窒素もしくはドライアイスで保存しながらクリーンベンチまで運びます。
  3. 直ちに、37℃に温めた培地を800μL加え、ピペッティングを行い急速解凍します。 (この操作が解凍を成功させるのに非常に重要です。)
  4. 細胞懸濁液を遠心チューブに移します。
  5. 約170×g (1,000rpm)、4℃で3分間遠心します。
  6. 上清を除き、新しい培地4mLに懸濁します。
  7. フィーダー細胞ディッシュに細胞懸濁液を移し、37℃のCO2インキュベーターで培養します。翌日から毎日培地交換します。通常3〜4日後には、継代可能な状態になります。
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