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記事ID : 5335

老化、ビタミンC、肺疾患研究に最適なキットが誕生しました!

SMP30・Gluconolactonase ウェスタンブロット・免疫組織染色キット プロトコール集


免疫組織染色

●ホルマリン固定パラフィン包埋切片の場合

1. 脱パラフィン

キシレン I 5分
キシレン II 5分
キシレン III 5分
100%エタノール 5分
100%エタノール 5分
95%エタノール 5分
90%エタノール 5分
80%エタノール 5分
70%エタノール 5分
PBS で洗浄(3 回) 5分

2. 抗原賦活処理

a:加熱処理(マイクロウェーブ・オートクレーブ・温浴など)
*【マイクロウェーブを用いた加熱処理方法】
耐熱性容器にスライドガラス上の組織が0.01 M クエン酸バッファー (pH 6.0) に充分に浸るようにする。電子レンジで5分間、加熱する。途中、吹き零れそうになったら、電子レンジを止めて沸騰がおさまってから再び加熱する。加熱後、 5分間冷ます。再び、電子レンジで5分間、加熱する。この時、組織が乾かないように、クエン酸バッファーが充分にあることを確認しておく。

b:酵素処理(トリプシン・ペプシン・Proteinase K など)

3. クエンチング

a:Peroxidase で発色する場合、内因性Peroxidase のブロッキング
1% 過酸化水素/メタノール溶液 15分反応後、PBS で洗浄(3 回) 5分 。

b:アビジン-ビオチンの系を使用する場合、内因性ビオチンのブロッキング
15 mM NaN3 含0.1%アビジン溶液 10分反応後、PBS で洗浄(3 回) 5分

4. 非特異的反応の阻止

ブロッキング液2%BSA/PBS-2%ヤギ血清 30分
(2%BSA/PBS にヤギ血清が終濃度2%になるように調製)

5. 一次抗体の反応

一次抗体 ウサギ抗SMP30・GNL 抗体 100〜500 倍希釈。
希釈は、ブロッキング液で行う。
湿潤箱で37℃、2 時間反応させる(4℃で一晩反応させてもよい)。
反応後、PBS で洗浄(3 回)

6. 二次抗体の反応(各社から様々な抗体、キットが販売されている)

・標識(HRP・FITC)二次抗体を使用する方法
・ビオチン化二次抗体を使用する方法
・ENVISION(DAKO 社製)を使用する方法など
反応後、PBS で洗浄(3 回)

7. 発色(Peroxidase 発色の場合)

DAB(ジアミノベンチジン)タブレット(シグマ社、DAKO 社製)を溶解して調製。
DAB 基質溶液を切片上に滴下。
発色させた後、蒸留水で反応停止。

8. 対比染色(核染色)

マイヤーのヘマトキシリン液(または3%メチルグリーン)で対比染色
染色後、流水で洗浄脱色 10〜15分

9. 脱水・透徹

80%エタノール 5分
90%エタノール 5分
100%エタノール 5分
100%エタノール 5分
キシレン I 5分
キシレン II 5分
キシレン III 5分

10. 封入

マウントメディウムで封入

【実験例】

●免疫組織染色
マウス肝臓を300倍希釈ウサギ抗SMP30・GNL抗体で免疫染色した。発色は、ジアミノベンチジン(3,3’-diaminobenzidine)で行った。野生型マウス(SMP30+/+)の肝臓では核と細胞質が染まっている。一方、SMP30・GNLノックアウトマウス(SMP30-/-)では全く染まっていない。


●免疫組織染色
マウス初代培養肝実質細胞を200倍希釈ウサギ抗SMP30・GNL抗体で蛍光染色した。肝細胞の核と細胞質が緑色に染まっている。

ウェスタンブロット

1. 泳動用サンプル調製(キット内容物)

(1) SMP30・GNL ノックアウトマウス肝臓 (タンパク濃度0.4 mg/mL)30 μL
(2) 野生型マウス肝臓 (タンパク濃度0.4 mg/mL)30 μL
(1)、(2)に同量の2X SDS-PAGE Lysis Buffer(30 μL)を加え、95℃、煮沸水浴中で5分間加熱する。直ぐに氷上で冷却し、遠心分離(10,000 rpm、5分間)後、上清を別のチューブに移し、泳動用サンプルとする。
1 レーンあたり10μL(1 レーンあたりのタンパク量は 2μg)泳動する。
2X SDS-PAGE Lysis Buffer(泳動時には1X 濃度)

**使用する試薬**
・125 mM Tris-HCl, pH 6.8
・4% SDS
・10% 2-mercaptoethanol
・20% glycerol
・0.01% bromophenol blue (BPB)

2. SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動

3. 膜への転写(膜は各社から販売されている)

PVDF 膜 など

4. 一次抗体の反応

一次抗体 ウサギ抗SMP30・GNL 抗体 1,000〜3,000 倍希釈
ブロッキング液5%スキムミルク/TBS(0.1% Tween 20 を含む) 30分
室温、3 時間反応させる(4℃で一晩反応させてもよい)。

**使用する試薬**
・TBS
・10 mM Tris-HCl, pH 7.5
・140 mM NaCl

5. 二次抗体の反応(二次抗体は各社から販売されている)

・ヤギ抗ウサギHRP 標識IgG を二次抗体に使用する方法
ブロッキング液5%スキムミルク/TBS(0.1% Tween 20 を含む) 30分
室温、1 時間反応させる。

6. 検出方法(各社から検出試薬が販売されている)

ケミルミネッセンス(化学発光)を使用する方法

【実験例】

●ウェスタンブロット
各レーン:マウス肝臓抽出物
野生型マウス (SMP30Y/+、SMP30+/+)
SMP30・GNL ノックアウトマウス (SMP30Y/-、SMP30-/-)
ヘテロマウス (SMP30+/-)
1,000 倍希釈ウサギ抗SMP30・GNL 抗体で検出した。
SMP30 (分子量34 kDa) のみ反応する。

●[資料提供 東京都老人総合研究所・老化制御 石神昭人先生]

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