Chemotaxis CytoSelect™ 96ウェル 細胞遊走アッセイキット（蛍光）

 商品情報 CytoSelect™ 細胞遊走アッセイ
（品番CBA-104、CBA-105、CBA-106）

1. 遊走細胞株
2. 細胞培養培地
3. 無血清培地（例えば、0.5% BSA・2 mM CaCl₂・2 mM MgCl₂を含むDMEM）
4. 細胞培養インキュベーター（37℃、5% CO₂）
5. 光学顕微鏡
6. 蛍光プレートリーダーに適した96ウェルプレート
7. 蛍光プレートリーダー

1. 滅菌条件下で、遊走チャンバープレートを10分間室温に置き、室温に戻しておきます。
2. 無血清培地に0.1〜1.0×10⁶ cells/mL（品番：CBA-106の場合）、もしくは0.5〜5.0×10⁶ cells/mL（品番：CBA-104、CBA-105の場合）を入れ、細胞懸濁液を準備します。細胞浸潤阻害もしくは刺激薬剤を細胞懸濁液に直接加えておきます。
   （NOTE：アッセイを行う前24時間飢餓状態にしておいた方がよいでしょう。）
3. 滅菌条件下で、フィーダートレイからカバーと膜チャンバーをとりはずします。
4. フィーダートレイのウェルに評価する化学誘因物質もしくは10% FBSを含む培地を150μL加えます。
5. フィーダートレイ（化学誘因物質を含む）に膜チャンバーを戻す。
   （NOTE： 膜の下に気泡が入らないようにする。）
6. ステップ2で用意した細胞懸濁液をやさしく混ぜ、100μLを膜チャンバーに加えます。
7. プレートをカバーし、2〜24時間インキュベーションします。
8. インキュベーションが終了する前に、96ウェル細胞収穫トレイのウェルに細胞剥離溶液を150μLずつ加え、室温に戻しておきます。
9. インキュベーションが終了したら、注意してインキュベーターから96ウェル遊走プレートをとりだし、フィーダートレイから膜チャンバーを外します（品番：CBA-104、CBA-105：ステップ13でフィーダートレイを使用するため液が入ったままとっておく）。
10. 吸引処理もしくは逆さまにして膜チャンバーの上層から非浸潤細胞及び培地を除去します。その膜チャンバーを細胞剥離溶液が入った細胞収穫トレイ（ステップ8）に置きます。それから37℃、30分間インキュベーションします。
11. 膜チャンバーを何回か緩やかに傾け、細胞を膜の底面から完全に剥離させます。
12. 品番：CBA-104、CBA-105の場合：新しい96ウェルプレート（キットには含まれていない）にフィーダートレイ中の溶液を各75μL、ステップ11の剥離溶液を各75μL入れます。
13. CyQuant® GRを4X溶出バッファーで1：75に希釈し（例えばCyQuant® GR dye 5μLに4X溶出バッファー370μLを加える）、十分量の4X溶出バッファー/CyQuant® GR染色溶液を準備します。
14. 各ウェルに4X溶出バッファー/CyQuant® GR染色溶液50μLを加えて20分間、室温におきます。
15. 蛍光測定に適した96ウェルプレートに混合液150μLを移します。蛍光プレートリーダー（480nm/520nm）で測定します。