Haptotaxis CytoSelect™ 細胞遊走アッセイキット（蛍光）

 商品情報 CytoSelect™ 細胞遊走アッセイ
（品番CBA-100-COL、CBA-101-COL、100-FN、CBA-101-FN）

1. 遊走細胞株
2. 細胞培養培地
3. 無血清培地（例えば、0.5% BSA・2 mM CaCl₂・2 mM MgCl₂を含むDMEM）
4. 細胞培養インキュベーター（37℃、5% CO₂）
5. 光学顕微鏡
6. 96ウェルマイクロタイタープレート（品番：CBA-100-COL、CBA-100-FNの場合）、蛍光プレートリーダーに適した96ウェルプレート（品番：CBA-101-COL、CBA-101-FNの場合）
7. マイクロタイタープレートリーダー（品番：CBA-100-COL、CBA-100-FNの場合）、蛍光プレートリーダー（品番：CBA-101-COL、CBA-101-FNの場合）

2-1. 品番：CBA-100-COL、CBA-100-FN、CBA-101-COL、CBA-101-FN共通

1. 滅菌条件下で、24ウェル遊走プレートを10分間室温に置き、室温に戻しておきます。
2. 無血清培地に0.5〜1.0×10⁶ cells/mLを入れ、細胞懸濁液を準備します。細胞遊走阻害もしくは刺激薬剤を細胞懸濁液に直接加えます。
（NOTE：アッセイを行う前24時間飢餓状態にしておいた方がよいでしょう。）
3. 遊走プレートの下層ウェルに、評価する化学誘因物質もしくは 10% FBSを含む培地を500μL加えます。
4. インサートに細胞懸濁液を300μLを加えます。
5. プレートをカバーし、2〜24時間インキュベーションします。
6. 注意しながらインサートから培地を吸引除去します。綿棒を使ってインサートの内側から非遊走細胞をやさしく除去し ます。その際、ポリカーボネート膜に穴をあけないように注意し、丁寧に内側周辺の細胞を除去してください。

2-2-1. 品番：CBA-100-COL、CBA-100-FN共通

7. 24ウェル遊走プレートの何も入っていないウェルに細胞剥離溶液400μLを入れておきます。
8. インサートをステップ7で用意した細胞剥離溶液が入ったウェルに移し、室温に10分間おきます。
9. ビーカーにはった水で、染色されたインサートを丁寧に何回か洗浄します。インサートを空気乾燥させます。
10.（オプション）高倍率にした光学顕微鏡で少なくとも任意3箇所のフィールドについて遊走細胞数を数えます。
11 . 空のウェルに各インサートを移し、1ウェルあたり抽出溶液200μLを加えます。オービタルシェーカーで振とうさせながら10分間インキュベーションします。
12. 96ウェルマイクロタイタープレートに各サンプル100μLを移し、プレートリーダー（OD560nm）で測定します。

2-2-2. 品番：CBA-101-COL、CBA-101-FN共通

7. CyQuant® GRを1X Lysis Bufferで1：300に希釈し（例えば4X溶解バッファー300μLに水900μLを加え、それからCyQuant® GR dye 4μLを加える）、十分量の1X溶解バッファー/CyQuant® GR dye溶液を準備します。
8. インサートの何も入っていないウェルに1X溶解バッファー/CyQuant® GR dye溶液を300μL入れます。
9. ステップ8で用意した1X溶解バッファー/CyQuant® GR dye溶液が入ったウェルにインサートを移して、10分間、室温におきます。
10. 蛍光測定に適した96ウェルプレートに混合液200μLを移します。蛍光プレートリーダー（480nm/520nm）で測定します。