2. アデノ随伴ウイルスの定量

セルバイオラボ社 アデノ随伴ウイルスによる遺伝子デリバリー　プロトコール内で使用した商品
    AAV-DJ ヘルパーフリー発現システム （品番：VPK-410-DJ）
    293AAV Cell Line （品番：AAV-100）
    ViraBind™ アデノ随伴ウイルス精製キット （品番：VPK-140）
    QuickTiter™ アデノ随伴ウイルス定量キット （品番：VPK-145）
    ViraDuctin™ アデノ随伴ウイルストランスダクションキット （品番：AAV-200）

※ここに掲載したプロトコールは、2013年4月現在のものです。実際にご使用される際には、キット及び試薬のプロトコールに準じて実験してください。

QuickTiter™ AAV Quantitation Kit （品番：VPK-145）
【構成内容】
1. ViraBind™ AAV Reagent A
2. ViraBind™ AAV Reagent B
3. QuickTiter™ AAV Capture Matrix
4. QuickTiter™ AAV Wash Solution (5X)
5. QuickTiter™ Solution C (10X)
6. CyQuant® GR Dye (400X)
7. QuickTiter™ AAV DNA Standard

≪キットに含まれないもの≫
1. 1X TE (10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA)
2. Fluorescence Plate Reader

 
測定原理

I.  精製されていないAAV-2及びAAV-DJサンプルの場合
※ 下記の方法は精製されていないAAV-2及びAAV-DJの1mＬ上清の定量に関して記載しております。AAVサンプルが1.0mL以下のものは血清フリーのDMEMを加え、1.0mLに調製して下さい。
1. ViraBind™ AAV Reagent A 1.0mLをウイルス上清に加え、よく混ぜます。
2. 37℃で30分間インキュベートします。
3. ViraBind™ AAV Reagent Bを30-60分間37度で確実に溶かします。ViraBind™ AAV Reagent B 50μLを2.のViraBind™ AAV Reagent Aで処理したウイルス上清に加えてよく混合します。
4. 37℃で30分間インキュベートします。
5. QuickTiter™ AAV Capture Matrix を予めゆっくり混ぜ、50μLをウイルス上清に加えます。
6. ウイルス上清とMatrixの混合液を、室温で30分間シェーカーの上で混ぜます。
7. 1,000 rpmで10分間遠心し、ペレットを得ます。
8. 注意深く、上清を除き、1X QuickTiter™ AAV Wash Solution を1mL 加え洗浄します。1,000 rpmで5分間遠心し、注意深く上清を除きます。
9. 洗浄の操作をもう一度繰り返し行い、上清をアスピレートします。残りのわずかな液体を除くため、もう一度2,000rpmで30秒間遠心し、ビーズをかき乱さないように、径の小さいピペットで、残りの上清を除きます。
10. 1X QuickTiter™ Solution C を20μL加え、30秒間ボルテックスします。75℃で1時間インキュベートします。30秒間、12,000 rpmでビーズをスピンダウンします。
11. 上清10μLを蛍光プレートリーダーに適したマイクロタイタープレートに移します。1X に調製した、フレッシュなCyQuant® GR Dye 90μLをウェルに加えます。480/520nmのフィルターセットを使用し、蛍光プレートリーダーで読み取ります。
12. AAVの力価はスタンダードカーブに基づき算出します。

II.  精製されたアデノ随伴ウイルスサンプルの場合
1. 精製されたAAVサンプル 13.5μlと10X QuickTiter™ Solution C 1.5μLをチューブ内で混ぜ、75℃で1時間インキュベーションします。凝縮したものを回収するため、軽くスピンし、室温で20分間インキュベーションします。
2. 熱処理をしていないコントロールサンプルを、精製されたAAVサンプル13.5μLと10X QuickTiter™ Solution C 1.5μLをチューブ内で混ぜ合わせ調製します。
3. コントロールサンプルを含む混合液10μLを蛍光プレートリーダーに適したマイクロタイタープレートに移します。1X に調製した、フレッシュなCyQuant® GR Dye 90μLをウェルに加えます。480/520nmのフィルターセットを使用し、蛍光プレートリーダーで読み取ります。AAVの力価はスタンダードカーブに基づき算出します。