プロトコール

SEPHAROSE®はGE Healthcare社の登録商標です。

！各試薬の組成につきましては、「準備するもの」の項をご参照ください。

1. Dynabeads Protein G (DYNAL/Invitrogen #100.03)をよく懸濁し、30μlをあらかじめ1XPBS (-)/0.5% BSA 1mlを入れておいた1.5ml Eppendolf DNA LoBind tubeへ取り分けます。
2. ローテーターにて ２〜５ 分間程度 室温で攪拌します。
3. 10,000 rpm 10秒間程度 4 ℃にて遠心し、上清をアスピレーターで除きます。（通常Dynabeads の洗浄には磁気スタンド（Dynal MPC-S DYNAL/Invitrogen #120.20）を用いることが多いですが、一部のビーズがチューブのふた内部に残ったり、アスピレーターで除く際にロスすることがあるため、遠心操作で上清を除いています。）
4. 1 mL の 1XPBS (-)/0.5% BSAを加え、ビーズをボルテックスにて懸濁したのち、ローテーターにて ２〜５ 分間程度 室温で攪拌します。
5. 10,000 rpm 10秒間程度 4 ℃にて遠心し、上清をアスピレーターで除きます。
6. 200μlの 1XPBS (-)/0.5% BSAを加え、さらに一次抗体（1-10μg 程度）を加え、ボルテックスにてよく懸濁したのち、ローテーターにて ４時間以上4 ℃でゆっくりと攪拌します（20-30 rpm/min程度）。

1. 10〜50 x 10⁶ 細胞を 適当量（10〜40 mL）の細胞培養用メディウムに懸濁し、15 mLまたは50 mLチューブに入れます。
2. 1/10容量 の 11 X fixation solution を加え（formaldehyde 1% final）転倒混和したのち、5〜20 分間24 ℃ 水浴にて時折攪拌しインキュベートします。
3. 1/10容量 の 1.5 M glycine を加え転倒混和したのち、直ちに氷水中に入れ反応を止めます。（メディウムのフェノールレッドの色が黄色に変わります。Glycine は formaldehydeと反応し、クロスリンク反応を止めます。）
4. Swing式の遠心機で1,500 rpm 5分間 4 ℃にて遠心し、上清をアスピレーターで除き、細胞をボルテックスにて懸濁します。
5. はじめの細胞懸濁液と等量の冷やしたFACS solution を加え細胞を懸濁し、ローテーターにて 5〜10分間 4 ℃で攪拌します。
6. Swing式の遠心機で1,500 rpm 5分間 4 ℃にて遠心し、上清をアスピレーターで除き、細胞をボルテックスにて懸濁します。
7. SDS lysis buffer（直前にProtease Inhibitor Cocktail、例えばNacalai Protease Inhibitor Cocktail, EDTA free, 100X SP 03969-21 などを1/100容量加えます。on iceにするとSDSが析出するので室温で調製します。）を、3 X 10⁶ 細胞あたり60μl（免疫沈降１反応分）の割合で加え、ピペットマン P-1000を用いてチップの先をチューブの底につけ、10回程度ピペッティングし細胞を懸濁・溶解します。（この時、泡を立てないようにしましょう。）懸濁液を200-300µlずつ1.5ml TPX チューブへ分注し、室温にて10分間静置します。（1.5ml TPX チューブはPolymethylpentene (PMP)で作られたチューブで、特にBioruptorによるソニケーションと寸断効率を高めると言われています。）
8. 密閉式超音波細胞破砕装置Bioruptorを用いて、Power LowまたはHigh, On 10 秒, Off 60 秒のサイクルで4サイクル程度、氷水で冷却しながら超音波処理を行います。（過剰な超音波処理は、免疫沈降の効率を下げますので注意しましょう。）
9. 15,000 rpm 10分間 4℃（SDSが析出する場合は 8℃程度に設定するとよい）にて遠心し、上清（約 200-300μL X 分注した本数分）を、あらかじめ9倍量のChIP dilution buffer （直前に100X Protease Inhibitor Cocktailを1/100容量加え、氷上で冷やしておきます。）を入れておいた適当な容量のチューブ（2 mLチューブ、あるいは5 mL〜15 mLチューブ）に回収し、希釈します。
10. Normal Rabbit IgG (Chromopure Rabbit IgG, whole molecule/Jackson Immuno Research社 011-000-003)をクロマチン溶解液1mlあたり5-10μg 程度加え、ローテーターにて 30分間以上 4 ℃で攪拌します。
11. 50% ProteinG-Sepharose / 0.5% BSA slurryをクロマチン溶解液1mlあたり30μL 程度加え、ローテーターにて1時間以上 4 ℃で攪拌します（preclear）。（preclear にDynabeads Protein Gを用いることもできますが、ここではProteinG-Sepharoseを使用しています。）
12. 3,000 rpm 3分間（5 mL〜15 mLチューブの場合）または10,000 rpm 10秒間（2 mLチューブの場合）4℃にて遠心し、上清を可溶性クロマチン分画とする。（上清100-200μLを Input分画として 4℃で保存します。）

1. 一次抗体と反応させた磁気ビーズを10,000 rpm 10秒間程度 4 ℃にて遠心し、上清をアスピレーターで除きます。
2. 1 mL の 1XPBS (-)/0.5% BSAを加え、ビーズをボルテックスにて懸濁したのち、ローテーターにて ３〜５ 分間程度4 ℃で攪拌します。
3. 10,000 rpm 10秒間程度 4 ℃にて遠心し、上清をアスピレーターで除きます。
4. 1 mL の 1 X RIPA buffer/ 150 mM NaClを加え、ビーズをボルテックスにて懸濁したのち、ローテーターにて ３〜５ 分間程度4 ℃で攪拌します。
5. 10,000 rpm 10秒間程度 4 ℃にて遠心し、上清をアスピレーターで除きます。
6. 2で調製した可溶性クロマチン分画を600 μLずつ、一次抗体を結合させたビーズの入った1.5ml Eppendolf DNA LoBind tubeに分注します。ローテーターにて一晩（12〜18 時間）4℃にて攪拌します（40-60 rpm/min程度）。
7. 可溶性クロマチン分画と反応させたビーズを1 mLの以下のバッファーで洗浄します。各段階は、バッファーを加えボルテックスにて懸濁した後、ローテーターにて 5分間以上 4℃にて攪拌し、同様に遠心、上清を除く操作を行います。バッファーは ice-cold に冷やしたものを用いましょう。抗体によってはこの洗浄の条件を検討してください。
   （1) 1 X RIPA buffer/ 150 mM NaCl　1回
   （2) 1 X RIPA buffer/ 500 mM NaCl　1回
   （3) LiCl wash solution　1回
   （4) 1 x TE　2回（アングル式の遠心機だとビーズがチューブ内壁に付着し、上清を除く際に一部吸ってしまうことが多いので、最後の遠心はできればswing式の遠心機を用いるとよい。）

1. 200μLのChIP direct  elution bufferをビーズに加え、ボルテックスにて懸濁します。 同様に遠心。ビーズはフェノール／CIAA 処理まで除く必要はありません。65℃にて４ 時間以上加熱し、クロスリンクをはずします。Input 分画もこの段階から併行して処理しましょう。
2. １μLの4 mg/mL RNase Aを加え、ボルテックスにて攪拌し、同様に遠心後、37℃にて 30分インキュベート。
3. １μLの10 mg/mL proteinase K  を加え、ボルテックスにて攪拌し、同様に遠心後、55℃にて 1時間以上インキュベート。
4. 1〜2 μLの  20 mg/mL Glycogen を加え、ボルテックスにて攪拌し、同様に遠心し、ビーズを残して上清を 1.5 mLシリコナイズチューブに移します。
5. 210 μL  のフェノール／CIAA を加え、ボルテックスにて攪拌し、15 krpm 3 分間室温にて遠心し、 上清（約 200 μL）を1.5ml Eppendolf DNA LoBind tubeに回収します。有機層に 180 μL  の 1 x TE- 200 mM NaCl  を加え、ボルテックスにて攪拌し、15 krpm 3 分間室温にて遠心しましょう（back extract）。 上清を回収し、先程の上清分画にプールし、ボルテックスにて攪拌後、軽く遠心します。
6. 800〜900 μL  の 100% Ethanolを加え、tiltingにてよく攪拌し、-20℃にて 2 時間以上静置。15 krpm 30分間以上 4 ℃にて遠心し、上清を除き、DNA の沈殿をice-coldの 75% ethanol でリンスします。
   15 krpm 5〜10分間  4℃ にて遠心し、ピペットマンのチップにて上清を完全に除きましょう。 2-5分程度 air dryし、Input DNA、ChIP DNAは 50-200μL の10mM TrisHCl (pH 8.0)に溶解します。-20℃で保存。

この技術情報は、滋賀医科大学　生化学・分子生物学講座　縣　保年　先生にご提供いただきました。