定量的shRNAスクリーニングによる新規幹細胞機能制御遺伝子の同定
佐賀大学医学部 特別講師　西岡 憲一　先生　ご寄稿

1. まえがき

佐賀大学医学部 特別講師　西岡 憲一

長崎大学医学部を卒業後、九州大学医学部で学位取得。クロマチン生物化学を基盤とし、独自の視点でクロマチン構造を介した転写メカニズムの解明をめざす。現在、幹細胞機能制御とのクロストークにも興味を持って研究を進めている。なお、スクリーニングで採れた新規遺伝子に興味を持ってくれる大学院生を募集中。

iPS細胞との絡みもあり、幹細胞機能の制御メカニズムの解明が急速に進んでいる。一方、この制御メカニズムにおいて重要な役割を担う遺伝子群として、ポリコーム群遺伝子と呼ばれる多細胞生物に特有な一連の遺伝子群が存在することが知られている。ポリコーム群遺伝子はヒトの癌においてもその発生や進行に強く関連していることから、再生医学・癌研究分野のクロストークのキーワードとして注目度が高い。

幹細胞機能を制御する新規遺伝子を同定しようという遺伝子スクリーニングが行われるのは近年の自然な研究の流れである。報告された主なものを表1にまとめた。驚いたことにこれらsiRNAライブラリーを用いたスクリーニングでは、重要であるはずの多くのポリコーム群遺伝子の中で、ある特定の遺伝子のみが採れてくる（表1・Rnf2及びYY1）。これら遺伝子が幹細胞にとって重要であることは言うまでもないが、スクリーニングの結果がすでに飽和レベルにあり、かつポリコーム群遺伝子産物の機能に影響を及ぼすような新規遺伝子のスクリーニングにはこれらの方法は適切でないことが示唆される。

実は、表1に示した方法はいずれも胚性幹細胞（ES細胞）を播種したプレート上の個々のウェルで、ある特定のRNA干渉を行い、レポーター活性もしくは表現型を検出するといういわゆるアレイ型ライブラリーを用いた方法である。アレイ型ライブラリーはハイスループットで多くの遺伝子を確実に検索できることが最大の利点だが、その他にES細胞のような種々のシグナルに高感受性で細胞周期や生存に影響が出現しやすい特性を持つ細胞を用いる場合にも利点がある。しかし、高額な試薬が必要であり、場合によってはレポーター検出に特別な設備が必要になるので、一般の研究者が気軽に利用できるものではない。一方で、近年利用できるようになったプール型レンチウイルスshRNAライブラリーでは、前述のような特性を持つ細胞には比較的不向きであるという欠点があった。プール型ライブラリーを用いる場合、アッセイ後に細胞コロニーを形成させて個々のコロニーを個別解析するか、shRNAコード領域を含むウイルスゲノムのみをPCR後に大腸菌内でクローニングしてこれを解析することで標的遺伝子を同定する方法が一般的な手法であったからである。それでも後者の大腸菌を介する方法は細胞増殖に伴うバイアスが比較的かかりにくいが、これまでにプール型ライブラリーにおいてはその品質管理がきちんと行われてこなかったので、同定したshRNAの検出頻度がどのくらい有意に高くなっているのか、単純にライブラリー中のもともとの存在比率を反映しているだけなのか、正確にはわからなかった。したがって、そのように得られた結果は二次スクリーニングの結果が出るまでは全く信頼できるものではなく、（研究者にとって都合の）良い遺伝子が採れるかどうかはライブラリー中の当該shRNAコンストラクトの含有率（運？）次第であった。これでは本当におもしろい解析対象を見逃してしまうことがあるかもしれない。

一般研究者レベルで幹細胞機能制御遺伝子をスクリーニングするには「定量性」を兼ね備えたプール型ライブラリーを構築する必要があった。そのようなライブラリーではもはや細胞コロニーの形成過程は不要であり、むしろそのような過程は新たなバイアスを生み出すことになるので、避けるべきであろう。さらに、検出したshRNAコンストラクトの全体に対する濃縮率が算出されるので、たとえ検出系がクリアな分解能を持たなくてもランキング化された一次スクリーニングの結果は意外と信頼性が高いことが期待できる。今回、セレクタ社とコスモ・バイオ社の協力を得て、バーコード付きレンチウイルスshRNAライブラリーを試すことができた。ここにこの次世代型ライブラリーを用いた定量的スクリーニング法が新規幹細胞機能制御因子の機能遺伝学的同定法として利用価値が高いことを報告する。

※ES：embryonic stem cells、na：not applicable