金属ナノ粒子プローブを使用したドットブロット法

4. イムノブロット ‐ 金属ナノ粒子を使用

貴金属ナノ粒子（金ナノ粒子、銀ナノ粒子）の抗体コンジュゲートは、比較的容易に調製できてかつ目視での検出が可能なため、検出プローブとして多くのアッセイで利用されています。例えば、ウェスタンブロットやドットブロットアッセイ、ラテラルフロー、垂直型フローアッセイ等の用途に適用されます。 また、各貴金属ナノ粒子は 特徴的な光学特性 を示すため、別の色の二次プローブを使用することによってマルチカラーの検出も可能です（図1）。

金ナノ粒子コンジュゲート などの貴金属ナノ粒子プローブを用いてブロットしたタンパク質を検出する場合、ナノ粒子プローブが結合することで標的タンパク質の存在は赤色で示されます（図1）。さらに、銀増感法（金標識体への銀粒子の沈着を原理とする増感法）を組み合わせることで、従来の比色検出方法と同等かそれ以上の高い感度で、ウェスタンブロットやドットブロット検出を行うことができます。また、金属ナノ粒子標識タンパク質コンジュゲートを用いた二次検出法は、標準的なウェスタンブロットプロトコールに適応し、検出スキームの大きな変更を必要としません。

金属ナノ粒子のタンパク質コンジュゲートを検出プローブとして使用するイムノブロットは、従来法と比較していくつかの利点があります。

利点

• 特別なデベロップメント試薬を必要としない
• 高価なイメージング機器は不要
• マルチカラー化が可能

金ナノ粒子プローブを用いてメンブレン上の抗原検出を行うための標準的なドットブロットプロトコールを以下に記載します。同様のプロトコールは、金ナノアーチン、銀ナノ粒子、金ナノアロイ標識タンパク質コンジュゲートプローブにも適用できます。

1. PBS（50 ug/ml BSAを含む）で段階希釈したタンパク質（0.1-100 ng） 1μl を、PVDF膜またはニトロセルロース膜にスポットします。
2. 滴下したタンパク質をメンブレンにしみこませ、乾燥させます。
3. 1％（w/v）ドライミルク（in 1×PBS）を用いて室温で30分間メンブレンをブロッキングします。
4. 室温で2時間、一次抗体と共にインキュベートする。
5. 上記で調製したブロッキング溶液でメンブレンを5分間×3回洗浄します。
6. 金コンジュゲート を0.2% ドライミルクで1:10（OD=0.3）に希釈し、2時間インキュベートします。
7. 同様に、5分間×3回洗浄します。
8. メンブレンを乾燥させ、データを記録します。
9. （オプション操作）感度を向上させるために、銀増感を行います。

図1．ドットブロットアッセイ例。
上図- 左上：ストレプトアビジン標識金ナノ粒子、右上：ストレプトアビジン標識銀ナノ粒子。
Cytodiagnostics社 silver enhancement kit for membranes 使用前と使用後。

下図- 異なる光学特性を有する貴金属ナノ粒子コンジュゲートの混合物を使用して、三つの異なる抗原の同時多重検出を示す。30nmの金/銀（20/80）合金標識抗ヒトIgG（緑）、30nm 金/銀（80/20）合金標識抗マウスIgG（赤色）、40nm金ナノ粒子標識抗ウサギIgG（紫）。

関連製品情報ページ

• 金ナノ粒子標識最適化キット
  （クエン酸安定化粒子／受動吸着）
• 金ナノ粒子標識キット
  （PEG-NHS活性化粒子／共有結合）