技術情報

Proteintech（PGI）社　プロトコール

記事ID ： 12454

1. 細胞及び組織のライセート調製

メーカー名：Proteintech Group, Inc.

Proteintech（PGI）社商品　FAQ・トラブルシューティング

商品詳細「プロテインテック（Proteintech）社抗体のご紹介」

■ 培養細胞

1. 遠心分離機を予め4℃に冷却しておきます。培養細胞のペレットを4℃、1000 x g（約2000rpm）で5分間遠心します。氷冷した1 x PBSで3回洗浄し、冷却したRIPAバッファー（プロテアーゼ阻害剤入り）を加えます。通常は、ペレット10⁶細胞当たり、RIPAバッファー100μLを加えます（遠心の前に細胞をカウントします）。より高いタンパク質濃度が必要な場合は、RIPAバッファーの容量を適宜減らしてください。ボルテックスして混合し、30分間氷上に保存します（時々ボルテックスしてください）。ステップ3に進みます。

■ 組織

2. 対象の組織を解剖し、血液の除去が必要な場合は冷却した1 x PBSで短く洗浄します。氷上で冷やしつつ、組織を小片にカットします。組織をホモジェナイザーにいれ、RIPAバッファー（プロテアーゼ阻害剤入り）を加えます。通常は、組織約10mgあたり、RIPAバッファー500μLを加えます。完全にホモジェナイズし、サンプルを30分間氷上に保存します（時々ボルテックスしてください）。ステップ3に進みます。

Top tip 1：
リン酸化タンパク質の抽出の場合は、溶解バッファーにホスファターゼ阻害剤を加えます。

■ 溶解及び保存

3. サンプルを超音波処理し、細胞又は組織を更に破壊し、DNAを切断します。サンプルに応じて超音波処理時間を調節してください。180ワットの出力で、細胞ライセートは1分間、組織ライセートは2-5分間（10秒超音波/10秒静止を1サイクルとして繰り返します）が目安です。超音波処理中サンプルは氷冷してください。

Top tip 2：
DNA分解のためのDNaseの添加は、酵素からタンパク質が汚染する可能性があるため、推奨しません。

4. 10,000 x g（半径9.5cmのローターで約9700rpm）、4℃で20分間遠心し、細胞の破片を沈殿させ、ペレットに触れないように、上清を新しいマイクロチューブに移します。

5. Bradford又はBCAタンパク質アッセイで、ライセートのタンパク質濃度を算出します。

6. サンプルは-80℃で長期間保存可能です。すぐにウェスタンブロットや免疫沈降に使用することもできます。

7. ウェスタンブロットの場合は、サンプルに4X SDSサンプルバッファーを最終濃度が1Xになるように加え、混合します。SDS-PAGEゲルにロードする前に、混合液を95℃で5分間加熱します。

■ バッファー

1 X PBS	1000 mL
10mM Na₂HPO₄	1.42 g
1.8 mM KH₂PO₄	0.24 g
137 mM NaCl	8 g
2.7 mM KCl	0.2 g
Adjust pH to 7.4
Add ddH₂O to 1000 mL

RIPA溶解バッファー	1000 mL
50 mM Tris•HCl, pH 7.4	50 mL
150 mM NaCl	8.76 g
1% Triton X-100 or NP-40	10 mL
0.5% デオキシコール酸ナトリウム	5 g
0.1 % SDS	1 g
1 mM EDTA (0.5 M stock)	2 mL
10 mM NaF	0.42 g
Add ddH₂O to 1000 mL 使用する直前に1mMになるようにPMSF及びその他のプロテアーゼ阻害剤を加える

4X SDSサンプルバッファー	1000 mL
12% SDS	120 g
25% Glycerol	250 mL
150 mM Tris•HCl (pH 7.0•1M stock)	150 mL
0.05% Bromophenol Blue	5 g
6% β-mercaptoethanol	60 mL
Add ddH2O to 50 mL, aliquot and store at -20°C