Proteintech（PGI）社商品 FAQ・トラブルシューティング
商品詳細 「プロテインテック（Proteintech）社抗体のご紹介」
本プロトコールの全てのステップは、特に記載がない限り、室温で実施してください。最適な染色結果を得るため、インキュベーションは、ロータリーシェーカーでゆっくり揺らしながら実施してください（神経細胞などの繊細な細胞株は除く）。
■ 固定及び透過処理
1. 培地を吸引し、播種したカバーガラス上の細胞を、すばやく1X PBSで洗浄します。
2. 細胞を、新しく1X PBSで調製した4％ホルムアルデヒドで10分間固定します。カバーガラスを1X PBSで3回（各3分間）洗浄します。
3. 1X PBSで調製した0.2％ Triton X-100で5分間透過処理します。カバーガラスを1X PBSで3回（各3分間）洗浄します。
■ ブロッキング
4. 正常血清に5％濃度になるように、1X PBSを加え、ブロッキング溶液を調製します。血清は、二次抗体の免疫動物種由来のものを選択してください。例えば、二次抗体がヤギ抗マウス抗体の場合は、ヤギ血清を選択します。細胞をブロッキング溶液で1時間インキュベートします（対応する血清が入手できない場合は、1％BSAを含む1X PBSを使用します）。
■ 抗体のインキュベーション
5. ブロッキング溶液を吸引し、抗体希釈バッファーで希釈した一次抗体を加えます。カバーガラスのうち1枚は、ネガティブコントロールとして、一次抗体を加えずに抗体希釈バッファーのみでインキュベートします。室温で1時間又は4℃でオーバーナイトインキュベートします（オーバーナイトの場合は、カバーガラスが乾かないように注意してください）。
6. カバーガラスを1X PBSで3回（各3分間）洗浄します。
7. 抗体希釈バッファーで希釈した適切な蛍光標識二次抗体をカバーガラスに加え、湿った暗所で１時間インキュベートします（蛍光試薬を添加した後は、できる限り暗い場所に置くようにしてください）
8. カバーガラスを1X PBSで3回（各3分間）洗浄します。
■ 封入及び観察
9. カバーガラスをHydromount （National Diagnostics（NDS）社製、品番：HS-106）で顕微鏡スライドに封入します。核染色が必要な場合は封入剤にDAPIを加えてください。
10. 蛍光顕微鏡でスライドを観察します。
■ バッファー
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