1. リコンビナントアデノウイルスの作製

• RAPAd® miRNA Adenoviral Expression System （品番：VPK-253）
  【構成内容】
  1. pacAd5 miR-GFP/Puro Shuttle Vector
  2. pacAd5 9.2-100 Vector
  3. pacAd5 CMV-GFP Control Vector
  4. pacAd5 CMV-ntLacZ Control Vector
  << キットに含まれないもの>>
  • トランスフェクション試薬
  • 制限酵素（PacI）
• 293AD Cell Line　（品番：AD-100）

I：miRNA Precursor のクローニング

mature miRNA の過剰発現用にmiRNA precursor を哺乳動物発現ベクター(pacAd ベクター、図2) にクローニングします。

・ miRNA precursor クローンのデザイン例（ヒトlet-7a-2 miRNA の場合）

1．miRNA のステムループ配列を Sanger' s miRNA database からダウンロードします。

2．miRNA ステムループ配列をBlast で検索します。

3．PCR とクローニング

1) 100bp のネイティブフランク配列をmiRNA の上流と下流に加えます。（100bp のflank 配列を含むHuman let - 7a - 2 miRNA precursar 配列の例）
GCCCAAATAGGTGACAGCACGATGAATCATTATAAGACTAACTTGTAATTTCCCTGCTTAAGAAATGGTAGTTTTCCAGCCATTGTGACTGCATGCTCCCAGGTTGAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTGAATTACATCAAGGGAGATAACTGTACAGCCTCCTAGCTTTCCTTGGGTCTTGCACTAAACAACATGGTGAGAACGATCATGATTCCTCCAGGCCTTTTCTCCCTATGAAAGGTAAGATTGGGTACGTTATTTTATGGTATTT

2) BamHI サイトを含むフォワードプライマー，NheI サイトを含むリバースプライマーを設計します。
（例）ヒトlet-7a-2 miRNA precursor の場合
Forward PCR Primer: tcga-ggatcc (BamHI)-21 nt
Reverse PCR Primer: tcga-gctagc (NheI)-21 nt

3) ゲノムDNA 由来のmiRNA をPCR で増幅させ，発現ベクターのBamHI/NheI サイトにそれぞれクローニングします。

4) インサートをDNA シーケンスによって確認します。
Forward Sequencing Primer: TTTGCACCATTCTAAAGAAT
Reverse Sequencing Primer: AAACCTCTTACATCAGTTAC

II：リコンビナントアデノウイルスの調製

1．ベクターをPac I によってリニア化します。

1) 十分量の目的遺伝子のクローニングされたpacAd5 シャトルベクターとpacAd5 9.2-100 Ad バックボーンベクターをPac I で制限酵素処理します。

2) 制限酵素処理したそれぞれのDNA と処理していないDNA 0.5μg を0.8%アガロースゲルに流し，完全にPacI で消化されているかどうかを確認します。

3) 制限酵素処理したDNA を精製し，滅菌した水に溶かし，-20℃で保存します。

2．トランスフェクション

1) トランスフェクション前に2×106 細胞を60mm 培養ディッシュに抗生物質を加えずに播きます。16-24 時間後，70-80%コンフルになった時点でトランスフェクションを開始します。

2) トランスフェクション試薬（Fugene® やLipofectamineTM Plus など）を用いてトランスフェクション後，次の日にトランスフェクション試薬が含まれる培地をアスピレートし，4mL の完全培地を加えます。

3) プラークの状態をチェックしながら7 日間インキュベートします。

4) トランスフェクション後10 日にプラークを確認し，培養ができていれば（50％以上）クルードウイルスライセートを回収します。
※ 15 日以上の培養は行わないでください。

3．クルードウイルスライセートの回収

1) アデノウイルスを含む細胞を5-10mL の滅菌したピペットで，プレートからはがし，回収します。細胞と培地を滅菌したチューブに移します。

2) 凍結融解を3 回繰り返し（37℃のウォーターバスとドライアイス- メタノールバス）ウイルスを細胞からリリースさせます。

3) 細胞溶解液を卓上遠心機で3000rpm，15 分間室温で遠心し，細胞残渣をペレット化します。

4) 得られたクルードライセート（ウイルスストック）を-80℃で保存します。

4．ウイルスの増幅

下記手順はT75 フラスコで行うことを推奨します。

1) インフェクション前に3-5x106 細胞を播きます。

2) 上記のクルードライセート50％を培地に加えます。

3) インフェクション中の24-48 時間は，顕微鏡で cytopathic effects（CPE）をチェックします。CPE がほとんど完了したら（ほとんどの細胞が円状でフラスコに完全に接着していない状態）培地をピペッティングして細胞を採取し，フラスコ表面から培地中に感染細胞を移動させます。

4) 感染細胞と培地を集め，1000 x g，5 分で遠心し，細胞をペレット化させます。

5) 上清を取り除き，細胞ペレットを培地または10 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl に再懸濁させます。

6) 凍結融解によって細胞懸濁液からウイルスをリリースさせます。
3000 x g，10 分間で遠心し，得られた上清をウイルスストックとして保存します。
＊ウイルス上清は-80℃に保存できますし，すぐに精製・タイター測定にも使用できます。

図1: アデノウイルス発現システムの概要

図2: pacAd ベクター