1. リコンビナントレトロウイルスの作製

Amphotropic Ecotropic Pantropic* Human +++ N.S. +++ Mouse +++ +++ +++ Rat +++ +++ +++ Monkey +++ N.S. +++ Cat +++ N.S. +++ Dog +++ N.S. +++ Hamster + N.S. +++ Bird N.S. N.S. +++ Fish N.S. N.S. +++ Frog N.S. N.S. +++ Insect N.S. N.S. +++ Mollusk N.S. N.S. +++ *Virus must be packaged with a pantropic envelope protein such as VSVG. N.S. = Not Suitable

Platinum Packaging Cell Line を用いたレトロウイルス発現システム
Platinum Packaging Cell Line はpol-gag 遺伝子およびenv 遺伝子（注1）が含まれています。

（注1）Plat-GP Cell Line にはenv 遺伝子は含まれません。

● Platinum-E Packaging Cell Line（品番：RV-101）
● pMXs-miRNA-GFP/Pur Retroviral Vector（品番RTV-017）

I：Plat-E パッケージングセルラインの培養

1．凍結細胞からPlat-E の起こし方

1．37℃のウォーターバス内で凍結細胞をすばやく溶かします。溶かした細胞を10mLの培養培地が含まれる15mLのチューブに懸濁します。

2．チューブを1,300〜1,500rpmで遠心します。

3．上清を捨て，指で軽くたたいて細胞のペレットを壊します。

4．数滴の培地を加え，緩やかに混合し，数回指でタッピングします。

5．2mLの培地をチューブに加え，緩やかに2回ピペッティングします。

6．細胞懸濁液を8mLの培地が入った10cm培養ディッシュに加えます。

7．円を描くようにディッシュをゆっくりと動かし，細胞を混ぜ，2-3日間培養します。
※完全なコンフル状態まで培養しないでください。70-90％コンフルになったら，2-3日毎に4ｘまたは6ｘに分けてください。
※培養操作中は，できるだけ泡ができないように気をつけてください。

2．細胞の分割

1．細胞が70-90%コンフルになったら，細胞をPBSで洗浄します。

2．4mLの0.05％ Tripsin / 0.5mM EDTA をディッシュに加え，37℃で3-5分間インキュベートします。

3．ディッシュのふちをタッピングし，ディッシュの表面から細胞を剥がします。

4．10mLの培地を50mLチューブに入れます。

5．同じピペットを使って，ディッシュの表面をやさしく3回，4mLのTripsin / EDTA で洗浄します。

6．細胞の懸濁液を7回，ゆっくりとピペッティングし，懸濁液をステップ4の培地の入った50mLチューブに入れます。

7．細胞を1,300-1,500rpmで遠心します

8．上清を捨て，指で軽くたたいて細胞のペレットを壊します。

9．数滴の培地を加え，緩やかに混合し，数回指でタッピングします。

10．5mLの培地をチューブに加え，緩やかに2回ピペッティングします。

11．15mLの培地を加え，細胞の数を数え，細胞を播きます。通常，10cm ディッシュ1枚あたり10⁷ 細胞です。

II：レトロウイルスの作成

1．クローニングトランスフェクション

1．目的遺伝子をレトロウイルスベクターにクローニングします。miRNA precursor のクローニング方法はセルバイオラボ社 アデノウイルスによる遺伝子デリバリー（1. リコンビナントアデノウイルスの作製）をご参照下さい。

※または，キットに含まれるpMX-GFP をコントロール実験用に使用します。

2．トランスフェクションの1日前に2x10⁶ 細胞を60mm 培養ディッシュに抗生物質を入れずに培養します。

3．16-24時間後，トランスフェクションを開始し，70-80％コンフルになるまで，培養します。
※細胞へのトランスフェクションは，FuGENE® Transfection reagent やLipofectamine™　Plusなどの試薬をご使用いただけます。トランスフェクションの条件は，各試薬のマニュアルをご参照ください。

4．トランスフェクション後48時間，レトロウイルスウイルス上清を培養してください。