セルバイオラボ社 レトロウイルスによる遺伝子デリバリー プロトコール内で使用した商品
技術情報
セルバイオラボ社 レトロウイルスによる遺伝子デリバリー
使用するキット
● ViraBind™ Retrovirus Concentration and Purification Kit （品番：VPK-130）
【特長】
・迅速：わずか3時間でウイルス精製
・高回収率：回収率は70％以上
・高純度：導入を妨げる成分を排除して濃縮
【構成内容】
・ViraBind™ Retrovirus Reagent A (100X)
・ViraBind™ Retrovirus Reagent B (100X)
・Purification Columns
・Centrifugal Concentrators
・Purification Buffer
プロトコール
I：精製と濃縮
図1 プロトコール
※下記の方法は，100mLのレトロウイルス上清の精製および濃縮用に記載しています。
※100mLより少ないウイルス上清をご使用される場合は，ReagentA，B（ステップ1）と精製バッファー（ステップ5）の量をご調整ください。
1．1mLのViraBind™ レトロウイルス Reagent A（100x）を100mL のウイルス上清に加えて混合します。混合後すぐに1mL のReagentB（100x）を加えて混合します。
2．37℃で60分間インキュベートします。
3．レトロウイルス混合液を15分間10,000ｘg で遠心します（ペレットがご確認いただけます）。
4．培地を注意深く吸い取り，ペレットを採取します。
5．ペレット化されたレトロウイルス複合体を2mLの精製バッファーで再懸濁します。ペレットを溶かす為にボルテックスします（白濁したように見えます）。
6．遠心チューブに溶かしたレトロウイルス複合体を入れ，10,000 x g で5分間遠心します。ここで，溶けなかった物質を除去します。上清を他のチューブに移します。
7．遠心型濃縮用チューブを組み立てます。（図2）
8．0.5mLの溶かしたレトロウイルス複合体を濃縮用チューブ内のsample reservoir にアプライします。
濃縮用チューブをセットし，卓上型遠心機で10,000 x g，10分間遠心します。
サンプルが濃縮されたら，次の濃縮チューブにレトロウイルスを追加して下さい。フロースルーは捨てます。
9．レトロウイルス液が200μl になるまで濃縮します。
10．清潔なリカバリーチューブを用いてレトロウイルス液を集めます。最終量が200μl になるように精製バッファーで調節します。
図2 遠心型濃縮用チューブ
II：精製カラム
1．精製カラム内（図3）のマトリクスを上下に振って完全に懸濁します（白濁するまで混合します）。
2．精製カラムを50mLのコニカルチューブに入れ，1,000rpm で3分間遠心します。
3．精製カラムの底のチップを取り除き，すぐに空の50mLコニカルチューブに入れます。青色のキャップを緩め，充填材の液を自然落下で落とします。
4．充填材の液が完全に落ちたら，200μlの濃縮したレトロウイルス液をカラムに加えます。充填材にいきわたるようにゆっくりと加えます。
5．濃縮したレトロウイルス液が充填材入れ，滴下が終わったら，コニカルチューブ内のフロースルーを捨てます。
6．ゆっくりと800μlの精製バッファーをカラムの上部に加えます。充填剤にいきわたるようにゆっくりと加えてください。滴下が終わったら，注意深く3mLの精製バッファーを同様に加えてください。
7．カラムの滴下が止まったら，精製カラムを新しい50mLのコニカルチューブに移します。
8．2.0mLの精製バッファーをカラムに加えて，フロースルーを採取します。
図3 精製カラム
III：バッファー置換と濃縮
1．遠心型濃縮用チューブを（図2）の通り組み立てます。
2．0.5mLのリカバーしたレトロウイルスフラクション（上記ステップ8）を遠心型濃縮用チューブ内のsample reservoirにアプライします。濃縮用チューブを卓上型遠心機に入れ，10,000 x g で5分間遠心します。フラクションサンプルが濃縮されたら，濃縮用チューブに追加のレトロウイルスをいれ，遠心します。フロースルーは廃棄します。
3．レトロウイルスフラクションを100μlになるまでsample reservoir 内で濃縮します。
4．400μl のPBS またはご希望のバッファーを濃縮用チューブに加え，100μl になるまで遠心します。
5．ご希望の量まで濃縮します。
6．新しいリカバリーチューブを用いて，濃縮されたサンプルを集めます。
