2.　トランスフェクションプロトコール　SAFETRANS (α-CDE)

【チャージ比 100 (carrier/pDNA 比) の場合】

1.　1 x 10⁴~2 x 10⁵ cells/well となるように 24 ウェルプレートに播種し、CO₂ インキュベータにて 1 日間培養する。 (40~60 % コンフルエント)

2.　無血清培地 200 uL/well を1.5 mL チューブに添加し、TE buffer (pH 7 ~ pH 8) に溶解した pDNA 2 ug/well を添加する。
(注：pDNA の品質は、トランスフェクション効率、再現性、毒性などに影響するため、高純度の pDNA をご使用下さい)

3.　a-CDE Transfection reagent (1 mg/mL) 189.3 uL を 2. のpDNA 溶液に添加する。5~6 回ピペッティングまたは 10 秒間ボルテックスして、溶液を混合する。

4.　室温 (15~25ºC) で 10~15 分間静置し、pDNA との複合体を形成させる。

5.　4.の複合体形成中に、24 ウェルプレートから細胞が剥離しないように静かに培地を吸引除去し、PBS または 無血清培地で 1 回洗浄する。

6.　24 ウェルプレートに無血清培地 200 uL/well を添加し、3. で調製した pDNA 複合体溶液を添加し、CO₂ インキュベータにて 1~3 時間インキュベート^注１）する。

7.　pDNA 複合体を含む培地を静かに吸引除去した後、PBS または無血清培地で 1 回洗浄を行う。

8.　細胞に新鮮な培養液 (血清含有) を添加し、24 時間インキュベートし、トランスフェクトした細胞の遺伝子発現を定量する。

注１）インキュベーション時間は適宜変更可能であり、24 時間インキュベーションしても細胞障害性はほとんどありません。

（※）本トランスフェクションプロトコールは、24 ウェルプレートにて培養した付着細胞に対して推奨しております。その他のチャージ比を用いてトランスフェクションする場合は、表 1に示す pDNA 量および導入試薬量を参照下さい。なお、それぞれの実験系においてトランスフェクション効率の最適化をお勧めいたします。

【チャージ比 100 (carrier/pDNA 比) の場合】

1.　1 x 10⁴~2 x 10⁵ cells/well となるように 24 ウェルプレートに播種し、CO₂ インキュベータにて 1 日間培養する。(40~60 % コンフルエント)

2.　無血清培地 50 uL/well を 1.5 mLチューブに添加し、RNase free water に溶解した siRNA 0.4 ug/well (siRNA の濃度は target gene に依存する) を添加する。

3.　a-CDE Transfection reagent (1 mg/mL) 37.9 uL を 2. の siRNA 溶液に添加する。2~3 回ピペッティングして、溶液を混合する。

4.　室温 (15~25ºC) で 10~15 分間静置し、siRNA との複合体を形成させる。

5.　4.の複合体形成中に、24 ウェルプレートから細胞が剥離しないように静かに培地を吸引除去し、PBS または無血清培地で 1 回洗浄する。

6.　24 ウェルプレートに無血清培地 220 uL/well を添加し、3. で調製した siRNA 複合体溶液を添加し、CO₂ インキュベータにて 1~3 時間インキュベート^注１）する。

7.　細胞に血清 30 uL/well を添加し、適切な時間 (24~48 時間) インキュベートし、トランスフェクトした遺伝子発現のアッセイを行う。

注１）インキュベーション時間は適宜変更可能であり、24 時間インキュベーションしても細胞障害性はほとんどありません。

（※）本トランスフェクションプロトコールは、24 ウェルプレートにて培養した付着細胞に対して推奨しております。その他のチャージ比を用いてトランスフェクションする場合は、表 2に示す　siRNA 量および導入試薬量を参照下さい。なお、それぞれの実験系においてトランスフェクション効率の最適化をお勧めいたします。

【チャージ比 100 (carrier/pSilencer (shRNA expressing vector) 比) の場合】

1.　1 x 10⁴~2 x 10⁵ cells/well となるように 24 ウェルプレートに播種し、CO₂ インキュベータにて 1 日間培養する。(40~60 % コンフルエント)
2.　無血清培地 200 uL/well を1.5 mL チューブに添加し、TE buffer (pH 7 ~ pH 8) に溶解した pSilencer 2 ug/wellを添加し、vortexing (10 s) する。
3.　a-CDE Transfection reagent (1 mg/mL) 189.3 uL を 2. のpSilencer 溶液に添加する。5~6 回ピペッティングまたは 10 秒間ボルテックスして、溶液を混合する。
4.　室温 (15~25ºC) で 10~15 分間静置し、pSilencer との複合体を形成させる。
5.　4.の複合体形成中に、24 ウェルプレートから細胞が剥離しないように静かに培地を吸引除去し、PBS または 無血清培地で 1 回洗浄する。
6.　3. で調製した a-CDE/pSilencer 複合体溶液を添加しCO₂ インキュベータにて 1~3 時間インキュベートする。^注１）
7.　細胞に血清 22.2 uL/well を添加し、適切な時間 (24~48 時間) インキュベートし、トランスフェクトした遺伝子発現のアッセイを行う。

注１）インキュベーション時間は適宜変更可能であり、24 時間インキュベーションしても細胞障害性はほとんどありません。

（※）本トランスフェクションプロトコールは、24 ウェルプレートにて培養した付着細胞に対して推奨しております。その他のチャージ比を用いてトランスフェクションする場合は、表 3に示すpSilencer 量および導入試薬量を参照下さい。なお、それぞれの実験系においてトランスフェクション効率の最適化をお勧めいたします。

1.　無血清培地 200 uL/well をチューブに添加し、RNase free water に溶解した siRNA または miRNA 0.4 ug/well (siRNA または miRNA の濃度は target gene に依存する) を添加する。
2.　a-CDE Transfection reagent 37.9 uL (ストック濃度 1 mg/mL) を 1. の siRNA または miRNA 溶液に添加する。2~3 回ピペッティングして、溶液を混合する。(15 分間静置)
3.　24 well plate に a-CDE Transfection reagent/siRNA or miRNA 複合体 (7.47 mg) を200 mL/well 添加する。
4.　細胞懸濁液 (5 x 10⁴ cells/mL) 200 uL/well を添加し、CO₂ インキュベータにて 1~3 時間インキュベート^注１）する。
5.　10% FCS 含有培地 500 mL に培地を交換し、CO₂ インキュベータにて 21 時間インキュベートする。
6.　トランスフェクトした遺伝子発現のアッセイを行う。

注１）インキュベーション時間は適宜変更可能であり、24 時間インキュベーションしても細胞障害性はほとんどありません。

（※）本トランスフェクションプロトコールは、浮遊および付着細胞に対して使用可能です。なお、それぞれの実験系においてトランスフェクション効率の最適化をお勧めいたします。