ssDNA検出による高感度かつ特異的なアポトーシス検出 ApoStrand™ ELISA アポトーシス検出キット

ApoStrand™ ELISA アポトーシス検出キットは、ELISA 法によりアポトーシス細胞中の一本鎖DNA（ssDNA）を選択的に定量することで、アポトーシスを検出します。

プログラム化された細胞死であるアポトーシスは、細胞を制御・組織化された様式で死に導く、高度に保存された生化学的な機構です。

本キットは、ELISA 法によりアポトーシス細胞中の一本鎖DNA（ssDNA）を選択的に定量することで、アポトーシスを検出します。一度に96サンプル測定可能なため、ハイスループットの検出に用いることもできます。また、ネクローシス細胞とは区別して検出できます。一回の作業時間は3〜4時間で、1ウェル中500〜5,000個のアポトーシス細胞を定量可能です（図2）。

• 高感度：500cell/wellのアポトーシス細胞を検出
• 特異的：アポトーシス細胞のみ測定
• 普遍的：アポトーシス細胞を普遍的に検出
• 短時間：全操作が3〜4時間で完了

• 100% ホルムアミド
• 抗体溶液
• ssDNA
• ブロッキング溶液
• ぺルオキシダーゼ基質
• 洗浄バッファー
• 蓋付き96穴プレート
• 固定剤

ホルムアミド変性に対するアポトーシス細胞のDNAの感受性と、ssDNAに対するモノクローナル抗体による変性DNAの検出に基づいて検出を行います。ホルムアミドは、アポトーシス細胞のDNAは変性しますが、壊死細胞やアポトーシス以外でDNAが分解した細胞のDNAは変性しない、温和な変性剤です。ホルムアミドに対するアポトーシス細胞DNAの感受性はDNAの分解にかかるのではなく、クロマチン凝集やDNAを安定化しているタンパク質の分解のような、アポトーシスによるクロマチンの変化を反映しています。このアッセイでは96 穴マイクロプレートに細胞を接着させ、接着細胞をホルムアミドと熱で処理し、アポトーシス細胞のssDNAを一次抗体とHRP標識二次抗体の混液で染色を行います。抗体混合液によるssDNAの1ステップ検出に基づく本プロトコールは、一般的な2ステップELISAと比べ高感度で作業量が少なくて済みます。この抗体混合液は即使用可能な状態でキットに含まれています。

図1．プロトコール

細胞の調製は以下の2通りの方法で行います。

1. 同一のプレートで細胞培養、アポトーシス誘導剤処理、染色と測定まで行う。
2. 細胞培養または組織から得られた細胞懸濁液をマイクロプレートに移し、染色と測定を行う。
   この細胞では、プレートに移す前にメタノールで固定して保存するか、プレートに移した後に固定するかのいずれかです。

図2. ApoStrand™ ELISAの特異性と感度。
メタノール固定したMDA-468細胞を染色した。接着細胞をスタウロスポリン処理し、浮遊してきた細胞を回収することで、純粋なアポトーシス細胞を得た。壊死はハイパーサーミア（HT）またはサポニン（SAP）により引き起こした。過酸化水素処理した細胞のデータは未処理と一致したため、示していない。

ヒドロコルチゾン処理したマウス胸腺（左図）とコントロール（右図）の顕微鏡写真。ホルマリン固定した組織切片をホルムアミド中で熱処理し、ssDNA（F7-26）抗体を用いて染色し、ヘマトキシリンでカウンター染色した。本抗体が凝縮したクロマチンとフラグメント化した核を染め、アポトーシス細胞を検出している（茶色い核）。

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