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研究用

毒性を持つインサートも安定化!迅速・簡単なクローニングベクターCloneSmart® ブラントクローニングキット(pSMART® Vectors)

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CloneSmart® ブラントクローニングキットは、pSMART®ベクターを用いた平滑末端DNAのクローニングキットです。本製品には前処理済みのベクターが付属し、目的配列を迅速・簡単にクローニングすることができます。

コピー数および抗生物質の異なる4種類の製品からお選びいただけます。

背景

Lucigen社 pSMART® ベクター

■ 迅速なクローニング

前処理済みベクターが含まれる本製品と高効率なコンピテントセルを組み合わせることで、迅速かつ効率的なクローニングが可能です。ライゲーション反応は、わずか30分で完了します。

■ インサートの安定化、Gap-Freeのクローニング

pSMART®ベクターは、転写/翻訳フリーであるため、ATリッチな遺伝子や塩基配列に毒性を有する遺伝子などの困難な配列もクローンニグすることができます。従来のクローニングベクターは、通常、インサート配列を転写するためのプロモーター(LacZプロモーター等)を有しており、この転写活性とそれに伴う翻訳によってコード領域や強力なプロモーター、短い反復配列、複雑な二次構造を含むインサートが不安定化する場合がありました。

pSMART®ベクターにはLacZ配列が含まれず、また、クローニング部位に隣接した転写ターミネーターによって転写がブロックされます。さらに、低コピー数のpSMART®ベクターを利用することで、通常のベクターでは保持できないような配列も安定化することができます。

■ バックグラウンドはありません

pSMART® ベクターは、あらかじめ切断され、平滑末端化、脱リン酸化処理された状態で提供されるため、通常の実験では99.5%以上の効率で組換えクローンを得ることができます。空ベクターを持つ組換え体の割合が非常に低いため(0.5%以下)、従来の青/白スクリーニングを必要とぜず、ナノグラム(ng)量のDNAからライブラリー構築が可能となります。

特長

構成内容


CloneSmart® ブラントクローニングキット
HCAmp HCKan LCAmp LCKan
20反応
40反応
20反応 40反応 20反応
40反応
20反応 40反応
40041-240041-440704-240704-440300-240300-440821-240821-4
4X CloneSmart ベクタープレミックス(Buffer、ATP、ベクターを含む)
1 x 50 μL 2 x 50 μL 1 x 50 μL 2 x 50 μL 1 x 50 μL 2 x 50 μL 1 x 50 μL 2 x 50 μL
 ・pSMART-HCKan Premix            
 ・pSMART-LCKan Premix            
 ・pSMART-HCAmp Premix            
 ・pSMART-LCAmp Premix            
CloneSmart® DNA リガーゼ(2 U/μL) 24 μL 2 x 24 μL 24 μL 2 x 24 μL 24 μL 2 x 24 μL 24 μL 2 x 24 μL
ポジティブコントロールインサートDNA
(500 ng/µL lambda HincII)
5 μL 2 x 5 μL 5 μL 2 x 5 μL 5 μL 2 x 5 μL 5 μL 2 x 5 μL
CloneSmart® シーケンス用プライマー(各200反応分)
 ・SL1 Primer(3.2 pmol/μL)
 ・SR2 Primer(3.2 pmol/μL)
各200 μL
各2 x 200 µL 各200 μL
各2 x 200 µL 各200 μL
各2 x 200 µL 各200 μL
各2 x 200 µL

ベクター情報

低コピーおよび高コピーpSMART® transcription-free クローニングベクター

図1. 低コピーおよび高コピーpSMART® transcription-free クローニングベクター

使用方法

■ インサートDNAの調製

ライブラリー構築の場合、300〜500ngのDNA量(サイズ:1000〜4000b)を推奨します。
1種類のDNAをクローニングする場合、インサート量は100〜200ngで十分です。日常的なクローニング実験では、100ng以下のインサート量でも上手くいきます。しかし、得られる形質転換体が少なくなる場合があります。

  1. 制限酵素処理、PCR、断片化等によって標的DNAフラグメントを調製します。
  2. 必要に応じて、DNAの平滑末端化、5'-リン酸化を行います。
  3. 70℃、10分間で熱変性させます。
  4. フェノール/クロロホルム抽出またはゲル電気泳動でDNAを精製します。
    (※256/302/312 nmのUV光を照射しないでください。) 

■ ライゲーション

  1. CloneSmart® ベクタープレミックスを遠心し、混合します。
  2. 1.5mLチューブに以下の溶液を調製します(リガーゼは最後に加えてください)。
    [トータルボリューム: 10μL]
    • X µL インサート DNA
      (100-500 ng、1–4 kb、平滑末端、5’-リン酸化)
    • Y µL H2
    • 2.5 µL 4X CloneSmart® ベクタープレミックス
      (pSMART® ベクター、ライゲーションバッファー、ATPを含む)
    • 1.0 µL CloneSmart® DNA リガーゼ
      (2 U/µL)
     
  3. 室温で30分間インキュベートします。
    (最大の効率を得るためには、インキュベート時間を2時間に延長してください。)
  4. 70℃、15分間でライゲーション反応を行います。
  5. 室温で15秒、氷上で15秒間冷やします。
  6. 12,000 rpmで1分間遠心してください。

■ コンピテントセルに形質転換

CloneSmart® アプリケーション別選択ガイド

ベクター インサートDNAの由来 アプリケーション
ベクター名コピー数コスミド、プラスミド、BAC、etc.ゲノムDNA、cDNA AT-リッチ “Difficult” 制限酵素処理、サブクローニング、シーケンシング PCR etc.
pSMART-HC Kan + + + ++ +
pSMART-LC Kan + + ++ + +
pSMART-HC Amp + + + ++ +
pSMART-LC Amp + + + + +
pJAZZR-OC 低-中
(誘導可能)
+ + +++ + +

CloneSmart® ブラントクローニングキット(pSMART® Vectors)

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
CloneSmart(R) HCKan Blunt Cloning Kit詳細データ LUC 40704-2 1 KIT
[20 reactions]
¥53,000
CloneSmart(R) HCKan Blunt Cloning Kit詳細データ LUC 40704-4 1 KIT
[40 reactions]
¥94,000
CloneSmart(R) LCKan Blunt Cloning Kit詳細データ LUC 40821-2 1 KIT
[20 reactions]
¥63,000
CloneSmart(R) LCKan Blunt Cloning Kit詳細データ LUC 40821-4 1 KIT
[40 reactions]
¥111,000
CloneSmart(R) HCAmp Blunt Cloning Kit詳細データ LUC 40041-2 1 KIT
[20 reactions]
¥53,000
CloneSmart(R) HCAmp Blunt Cloning Kit詳細データ LUC 40041-4 1 KIT
[40 reactions]
¥94,000
CloneSmart(R) LCAmp Blunt Cloning Kit詳細データ LUC 40300-2 1 KIT
[20 reactions]
¥63,000
CloneSmart(R) LCAmp Blunt Cloning Kit詳細データ LUC 40300-4 1 KIT
[40 reactions]
¥111,000

[関連]推奨コンピテントセル

最大の形質転換効率を得るために、E. cloni® 10G ELITE または10G SUPREME エレクトロコンピテントセルを推奨いたします。
アプリケーションによっては、E. cloni 10G ケミカルコンピテントセルもご使用いただけます。

商品名 24 Reactions 形質転換効率
SOLO SOLO
E. cloni 10G SUPREME Electrocompetent Cells 60081-2 60081-2 > 4 x 1010 cfu/μg
E. cloni 10G ELITE Electrocompetent Cells 60051-2 60051-2 > 2 x 1010 cfu/μg
E. cloni 10G Chemically Competent Cells 60106-2 60106-2 > 1 x 109 cfu/μg
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製品使用文献

CloneSmart® Cloning Kits

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商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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