リン酸化抗体の除去、リプロービングに有用リン酸化抗体のストリッピング溶液

リン酸化抗体のストリッピング溶液は、ブロット膜上に固定化したタンパク質に大きな影響を与えることなくリン酸化抗体のみを剥がし、同じ抗体あるいは異なる抗体で再度ブロット膜と反応（リプロービング）させることができます。
操作は室温で行い、過熱操作などは必要ありません。

ストリッピングとリプロービングについて

タンパク質のリン酸化-脱リン酸化は、遺伝子発現、細胞接着、細胞周期、細胞増殖、分化等、タンパク質の機能的特性を調節する主なシグナル機構の一つです。タンパク質は、タンパク質キナーゼにより特定のセリン、スレオニン、もしくはチロシンがリン酸化されます。ェスタンブロッティングでリン酸化タンパク質特異的抗体を用いることは、シグナル伝達研究分野では一般的となっています。

一方、効果的にリン酸化抗体を除去（ストリッピング）しリプロービングする手法は、いくつかの点において有用です。

• 同じブロットを再利用することによって試薬と時間のコスト削減
• いくつかの異なる抗体を使用して、ブロッティング解析可能
• 同一または異なる抗体によって、異常な結果の再解析および確認が可能

• ブロット膜上に固定したタンパク質に影響なくリン酸化抗体のみを除去
• 同一または異なる抗体でリプロービングブロット
• 室温プロトコル - ブロット膜の加熱は必要ありません

1. 75Xのストック溶液を、ドラフト内でdH2Oを用いて希釈し、1Xリン酸化抗体ストリッピング溶液を調製し、よく混合します。
2. ブロット膜を1Xリン酸化抗体ストリッピング溶液に浸し、穏やかに混合しながら、室温で90〜120分間インキュベートします。
   （ブロット膜を完全にカバーするのに十分な容量をご使用ください。）
3. TBSTで2回洗浄します。
4. リン酸化抗体の完全な除去を確認するために、二次抗体でブロッティングを実施し、ECL検出します。
5. 適切にストリッピング処理されたことを確認後、同一または異なる抗体でリプロービングしてください。

図．4G10リン酸化チロシン抗体のブロットおよびストリッピング
血清刺激を与えたCOS-7細胞のライセート15μgを、4G10リン酸化チロシン抗体のウェスタンブロットに使用した。同じブロット膜を、リン酸化抗体ストリッピング溶液でストリップした後、HRP標識二次抗体（コントロール：Ctrl）または、4G10 一次抗体(4G10)/HRP標識二次抗体でリプローブし、ECL検出した。フィルムは、4G10ブロットは30秒間、コントロールブロット30分間露光した。

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