生体試料中のアデノシン一リン酸を蛍光検出 アデノシン一リン酸アッセイキット

アデノシン一リン酸(AMP)はリン酸基、糖のリボース、核酸塩基のアデニンからなるヌクレオチドです。AMPはしばしばアデノシン二リン酸(ADP)またはアデノシン三リン酸(ATP)に変換されるので、AMPは種々の代謝反応の重要な部分です。AMPはRNA鎖合成の構成成分です。AMPは、細胞の遊走、カルシウムシグナル伝達、サイトカインの分泌を制御する酵素であるAMP活性化プロテインキナーゼ(AMPK)、および樹状細胞などの免疫細胞におけるT細胞プライミング能を調節します。本キットは、生体試料中に存在するアデノシン一リン酸の量を96ウェルのマイクロタイタープレートを用いて測定する簡便な蛍光測定アッセイです。各キットには、ブランク、アデノシンリン酸標準品、未知試料など、最大100のアッセイ*を実施するのに十分な試薬が含まれています。試料のアデノシン一リン酸濃度は、既知のアデノシン一リン酸標準物質との比較によって決定されます。本キットの検出感度は1.6µMアデノシンリン酸です。
*注:各検体のreplicateには2種類のアッセイが必要であり、1種類はピルビン酸リン酸ジキナーゼ(+PPDK)で処理し、1種類は処理しません(-PPDK)。アデノシンリン酸は、2つのウェルからのRFU測定値の差から計算されます。

本キットは、生体試料内の総アデノシン一リン酸を測定します。アデノシン一リン酸(ピロリン酸とホスホエノールピルビン酸を伴います)はPPDKによってピルビン酸+アデノシン三リン酸(ATP)とリン酸に変換されます。ピルビン酸はリン酸と酸素の存在下でピルビン酸オキシダーゼによってアセチルリン酸、二酸化炭素、過酸化水素に変換されます。次に、得られた過酸化水素を、高度に特異的な蛍光プローブで検出します。西洋ワサビペルオキシダーゼはプローブと過酸化水素の反応を触媒し、1:1の比率で結合します。検体を96-ウェルマイクロタイタープレート法で既知濃度のメチオニンアデノシン1リン酸標準物質と比較する。試料および標準物質を30分間インキュベートした後、標準的な96ウェル蛍光プレートリーダーで読みます(図1)

図１：アデノシン一リン酸の測定原理

• AMP スタンダード
• ピロリン酸塩
• リンオルピルベート(PEP) 100mM
• Na₂HPO₄（100ｍM）
• 蛍光プローブ
• Flavin Adenine Dinucleotide(FAD) (2mM)
• チアミンピロリン酸塩(TPP) (2mM)
• ピルビン酸オキシダーゼ
• リン酸ピルベートジキナーゼ(PPDK)
• 10×アッセイバッファー

図2:アデノシン一リン酸アッセイキットを用いた293T細胞におけるアデノシン一リン酸の検出
293T細胞は、上記のサンプル切片の調製に従い均質化し、除タンパク質した。

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