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商品情報

記事ID : 13266
研究用

抗体・アプタマーに代わる次世代検出試薬Affimer 探索受託サービス
Avacta Life Sciences社:抗体・アプタマーに代わる次世代検出試薬

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Affimer とは?

Affimer とはターゲット分子に対する親和性と特異性を有し、抗体と同じように様々なアプリケーションで使用することができる約 13 kDa の改変小分子タンパク質です。ターゲット特異的な Affimer は動物免疫ではなく、巨大な Affimer ライブラリーから in vitro スクリーニングにより選別します。また Affimer は 1 アミノ酸のみ異なるタンパク質や活性型および非活性型の構造変化、タンパク質発現レベルの僅かな違い等も区別して検出できます。

Affimer の紹介

Affimer と抗体の比較
特徴
Affimer
モノクローナル抗体
分子量
12〜14 kDa
150 kDa
開発納期
最大 12 週間
最大 9 ヶ月
アフィニティー
低い 2 桁〜1 桁 nM の範囲でご要望に応じて探索可能
様々 (nM 〜 pM range)
特異性
タンパク質アイソフォームや小分子 - タンパク質複合体の検出など、ニーズにより調整可能
特性のコントロールは困難
標的レンジ
免疫システムによる制限がないため非常に幅広い
免疫システムによる制限あり
製造
in vitro ファージディスプレイと高収率の細菌発現系
動物免疫
供給安定性
長期間の一貫したバッチ間再現性を実現する組換えタンパク質
ハイブリドーマからの発現は不安定になり得る
安定性
広範な化学的条件、pH、温度で安定 多様な生物物理学的特性および安定性

 

Affimer の構造

Affimer は生物学的に不活性であり、物理的に安定な改変システインプロテアーゼインヒビターを基本構造としています (図 1)。この基本構造にはヒトのプロテアーゼインヒビターである Stefin A を改変したType-I と、植物シスタチンを改変した Type-II が存在し、両タイプの三次構造はほぼ相同です。Affimer の標的結合部位はループ 1 および 2 であり、この領域にアミノ酸の多様性をもたせることで Affimer ライブラリーを調製しています。N および C 末端は蛍光色素や様々なタグ、酵素、リガンドを用途に応じて容易に修飾可能です。また、Affimer 構造中からシステインを除いているため大腸菌内でジスルフィド結合が形成されず、ロット間差なく容易に発現・精製することが可能です。さらに、Type-I Affimerはヒト由来のタンパク質には結合しないよう改変されているため off-target 効果を最小限に抑えられます。

Affimer Type-I および Type-II の基本構造
図1.Affimer Type-I および Type-II の基本構造

Affimer 7つの利点

1.親和性と特異性

例(1)高親和性
4 つの Affimer 候補 (Ψ で表記) が 酵母 SUMO のみを特異的に認識し、ヒト SUMO には結合しないことを direct ELISA で確認しました (図2)。また等温滴定型熱量測定 (ITC) の結果から本 Affimer の Kd は約 30 nM でした。通常 Affimer の結合親和性は Kd = 3-30 nM の範囲です。

Affimer の種特異性と標的親和性
図2.Affimer の種特異性と標的親和性

 

例(2)高特異性
抗マウス IgG2b 抗体 Affimer(14-G12)はマウス IgG2b のみを特異的に認識し、その他のサブタイプにはほぼ反応性を示しません(Direct ELISA)。また、本抗体を Horiba EZ-Plex SPRi platform を用いて動態解析を行ったところ、その KD 値は 3 nM でした。

 

抗マウス IgG2b 抗体 Affimer (14-G12) のサブタイプ特異性と KD 値の測定

図3. 抗マウス IgG2b 抗体 Affimer (14-G12) のサブタイプ特異性と KD 値の測定

 

例(3)活性型と非活性型の識別
CDK2 は細胞内で単量体の非活性な状態と、リン酸化され Cyclin A と複合体を形成して活性化している状態が存在しますが、この両者を区別する抗体は存在していません。Avacta 社は活性化 CDK2 のみを認識し、非活性化 CDK2 を認識しない Affimer の探索に成功しています (図4)。

SPR による Affimer の活性型 CDK2 特異性解析
図4.SPR による Affimer の活性型 CDK2 特異性解析

 

2.迅速な探索

ターゲット特異的な Affimer は 1010~1013 の Affimer ライブラリーを in vitro スクリーニングすることにより探索されます。探索後に最も特異性の高いAffimer を納品するまでに要する期間は約 8-9 週間であり、モノクローナル抗体作製期間に比べて非常に短期間です。

3.品質

品質と安定供給が保証されます。納品される Affimer は配列解析し、大腸菌発現で製造されます。また、Affimer はロット間差なく安定供給されることを保証致します。

4.構造安定性

Affimer はシングルドメインタンパク質であり、約 80℃の高温下でも安定です (図5)。また、pH 2~12 の範囲でも抗体に比べ非常に高い安定性を有しています (図6)。 更に結合能を失うことなく金やガラス、プラスチック表面に固定化することが可能であり、バイオマーカー探索のためのマイクロアレイを構築できます (図7)。

ALS_affimer_5.jpg
図5.Type-II Affimer 骨格と酵母 SUMO 特異的 Affimer の熱安定性 (示差走査熱量計分析)

 

ALS_affimer_6.jpg
図6.Type-I Affimer 骨格と IgG の pH 安定性比較

 

ALS_affimer_7.jpg
図7.ガラススライド上にプリントされた 45,000 種の Affimer

 

5.スモールサイズ

Affimer はある種の膜や組織を透過できるほど小さいため、広範なイメージング手法に最適な検出試薬です。また様々なアッセイ、センサー等の固相に高密度に固定化できるため S/N 比を改善することが可能です。

6.機能化の容易性

Affimer は蛍光色素や様々なタグ (V5, c-myc, HA, N 末端システイン等)、酵素、リガンドを用途に応じて容易に修飾可能なため、新しいアッセイ系の構築を迅速に行うことが可能です。

7.ライセンス

Avacta 社は Affimer の知的所有権を保有しており、様々なアプリケーションやターゲットに対してライセンスすることが可能です。Avacta 社は 2013 年にイギリスの Blueberry Therapeutics Ltd と薬剤耐性菌感染症に対する治療薬の開発に Affimer を使用するライセンス契約を締結した実績がございます。

 

Affimer カタログ製品

製品化されているAffimer試薬は、下記カテゴリからご覧いただけます。

 

Affimer 探索受託サービス

ご希望の標的物質に対する特異的な Affimer を探索して納品致します。

Step 1.スクリーニング
Avacta 社は Typ-I および Type-II Affimer 骨格の標的認識部位であるループ領域に多様性を持つオリゴヌクレオチドプールとM13 phagemid vector を用いて調製した 1010 のファージライブラリーを所有しています。このライブラリーを用いて標的に特異的な Affimer を 4 ラウンドのファージディスプレイ法で探索します。 *標的物質に応じて 108 酵母 two-hybrid ライブラリーを使用致します。

Step 2.QC
選択された Affimer 候補の親和性と特異性をマイクロアレイ、免疫沈降、ウエスタンブロットで確認します。ご希望に応じて IHC, ICC, ELISA 等も実施可能です。この過程で選択された トップ3 の Affimer 候補をお客様に納品させて頂き、最適な Affimer をご選択頂きます。

Step 3.納品
ご選択頂いた Affimer のプラスミド を納品致します。

 

Affimer 開発プロセス

 

  • 必要な標的タンパク質量: 100 ug
  • 標的タンパク質の純度:95% 以上
  • 標準納期:8〜9 週間
  • 実績:製薬、臨床検査、食品安全等様々な領域の企業 50 社以上のタンパク質、ペプチド、小分子に対する Affimer の探索を行い、探索成功率は 90% 以上です。得られた Affimer の kD 値は 3-30 nM という高い親和性を有していました。

ご注意:本サービスの結果得られた Affimer は研究用用途に限りご使用頂けます。商用利用をご検討のお客様はお気軽にご相談ください。

 

Affimer 最新技術情報

Introduction and Key Feature ComparisonPDF

Affimer Technology for Therapeutics and Reagents PDF

お見積り・ご注文方法

下記のリンクから見積のご依頼をお願い致します。

お問い合わせ先 : 創薬・受託サービス部

ご質問・ご不明の点は創薬・受託サービス部までお問い合せください。また、秘密保持契約のご希望につきましても、下記までご連絡をお願いいたします。

TEL
03-5632-9615
FAX
03-5632-9614
E-mail
jutaku_gr@cosmobio.co.jp
参考文献

Stadler et al. (2011) Structure-function studies of an engineered scaffold protein derived from Stefin A. II: Development and applications of the SQT variant. PEDS 24(9) 751-63.

Tiede et al. (2014) Adhiron: a stable and versatile peptide display scaffold for molecular recognition applications. PEDS 27(5) 145-155.

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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