生体サンプル中のスフィンゴミエリン阻害剤のスクリーニングに！ Amplite™ 蛍光スフィンゴミエリンアッセイ

Amplite™ 蛍光スフィンゴミエリンアッセイは、生体サンプル中のスフィンゴミエリン(SM)を高感度に検出するキットです。

スフィンゴミエリンとは

スフィンゴミエリンは、主に細胞膜の細胞外小葉に見られるスフィンゴ脂質の一種です。ニューロンでは、軸索を取り囲む膜状のミエリン鞘に最も豊富に存在し、シグナル伝達に重要な役割を果たしています。スフィンゴミエリンは、シグナル伝達経路における重要なメディエーターであるセラミドの前駆体としての重要な機能的役割を果たしています。臨床生物学において、スフィンゴミエリンレベルのモニタリングは、脾臓、肝臓および脳におけるスフィンゴミエリンの有害な蓄積をもたらす脂質貯蔵障害であるニーマンピック病を評価するための有用なバイオマーカーとなります。

原理

酵素結合を利用した本アッセイにおいて、スフィンゴミエリンはスフィンゴミエリナーゼによって加水分解されてホスホリルコリンを生じます。スフィンゴミエリンの濃度に比例して生成されるホスホリルコリンのレベルは、ABD社のAmplite™Red蛍光プローブを使用して測定されます。このアッセイでは、は蛍光マイクロプレートリーダー（Ex / Em = 540 / 590 nm）を用いて、シグナルを検出します。

• 中性スフィンゴミエリンの定量に
• 血液、細胞溶解液、溶液などの生体サンプル中のSM阻害剤のスクリーニングに

• 自動化に最適：溶液除去や分離操作不要
• 簡便："mix and read"アッセイかつ
  96ウェルまたは384ウェルのマイクロタイタープレートに対応　(DSより)
• 高感度：1 µMのスフィンゴミエリンを検出

• Component A: Enzyme Mix
• Component B: Sphingomyelinase
• Component C: Amplite™ Red
• Component D: SMase Reaction Buffer
• Component E: Assay Buffer
• Component F: 50 mM Sphingomyelin
• Component G: DMSO

1. スフィンゴミエナーゼワーキング試薬の調整
2. スフィンゴミエリンスタンダード及びテストサンプルの添加
3. 37℃で1-2時間インキュベート
4. スフィンゴミエリンアッセイミックスを添加
5. 室温で30分〜2時間インキュベート
6. 蛍光強度Ex/Em = 540/590 nm (cut off at 570 nm)で測定

図.1 Amplite™ 蛍光スフィンゴミエリンアッセイキットを用いたスフィンゴミエリンの用量反応
96ウェル黒色プレート使用、Gemini蛍光マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)で測定
インキュベーション時間：60分にて、1 µMのスフィンゴミエリンを検出 (n=3)
（メモ: 蛍光バックグラウンドは時間とともに増加します。各データポイントについてブランクウェルの蛍光強度値を差し引くことが重要です。）

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