生体試料中のピルビン酸塩を定量 Amplite™ ピルビン酸アッセイ (比色 / 蛍光)

Amplite™ 比色ピルビン酸アッセイは、生体サンプル中のピルビン酸塩を定量するキットです。

ピルビン酸塩とはピルビン酸の共役塩基であり、いくつかの代謝過程で使用される重要な中間体です。解糖の代謝経路では、1分子のグルコースが2分子のピルビン酸塩に変換されます。 生細胞は、ピルビン酸を利用してエネルギーを供給します。酸素が存在すると（好気的呼吸）、ピルビン酸塩はピルビン酸デヒドロゲナーゼによってアセチル-CoAに変換され、クエン酸回路に入ATPが生成されます。酸素濃度が不足すると、ピルビン酸塩は嫌気的に分解され、動物では乳酸が、植物や微生物ではエタノールが生成されます。臨床生物学において、ピルビン酸塩は代謝障害および肝疾患の評価のための有用な診断マーカーとして知られています。

原理

本酵素結合アッセイでは、ピルビン酸塩はピルビン酸オキシダーゼによって酸化されて過酸化水素を生じます。生成された過酸化水素のレベルは、独自のQuest Fluor™ピルビン酸センサーを使用して測定されます。このセンサーは、サンプル中のピルビン酸塩濃度に比例したシグナルを生成します。Amplite™蛍光ピルビン酸アッセイも同様のアプローチを利用しています。 このアッセイでは、吸光マイクロプレートリーダー（575 nm）または蛍光マイクロプレートリーダー（Ex / Em = 540 / 590 nm）を用いて、シグナルを検出します。

• 高感度：
  比色 / 6 µMのピルビン酸塩を検出
  蛍光 / 0.3 µMのピルビン酸塩

• Component A: Quest Fluor™ Pyruvate Sensor
• Component B1: Enzyme Mix 1
• Component B2: Enzyme Mix 2
• Component C: Assay Buffer
• Component D: Pyruvate Standard
• Component E: DMSO

1. 段階希釈したピルビン酸スタンダードとテストサンプルの調整
2. 同量のワーキング試薬を添加
3. 室温で30分-1時間インキュベート
4. 吸光度を575 nmで測定、または蛍光強度（Ex/Em = 540/590 nm (Cutoff = 570 nm)）で測定

図.1 Amplite™ 比色ピルビン酸アッセイキットによるピルビン酸塩の用量反応
96ウェル白色クリアプレート使用/ インキュベーション時間　30分間
SpectraMaxマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）で測定
6 µMのピルビン酸塩を検出

図.2 Amplite™ 蛍光ピルビン酸アッセイキットによるピルビン酸塩の用量反応
96ウェル黒色プレート使用/ インキュベーション時間　30分間
Geminiマイクロプレートリーダー（Molecular Devices）で測定
0.3 µMのピルビン酸塩を検出

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