抗炎症解析のファーストステップに アルギナーゼ活性測定キット

アルギナーゼは、L-ArginineをL-Ornithineと尿素に加水分解する酵素です。マクロファージの機能的分類の1つとして知られるM1（炎症性）/M2（非炎症性）のM2にマクロファージが活性化された際、強く発現することが知られており、M2マクロファージ活性化のマーカーとして頻用されています。

図1. マクロファージのM1／M2型の違い
マクロファージは白血球の一種で、死細胞など体の中の異物を取り込んで消化するほか、免疫機能を担っている。

本製品は、細胞内のアルギナーゼ（Arginase）を抽出し、アルギナーゼがL-Arginineから生成する尿素を呈色反応で検出することで、アルギナーゼ活性を評価します。従来の測定法に比べ、試薬の安定性・感度を改善し、簡便にアルギナーゼ活性を測定することができます。

※本製品は、京都大学・田畑泰彦教授及び東京応化工業株式会社が保持する特許（出願中）に基づき、コスモ・バイオ株式会社が特許実施許諾を受けて、製品化しています。

図5. 使用例
マウス初代ミクログリア（品番：MGC57）を96well プレートに5×104 cells/well で播種し、1日培養後、各濃度のLPSを培地に添加し、48時間後に細胞を溶解し、アルギナーゼ活性測定キットを用いてアルギナーゼ活性を測定した。

測定前準備

■尿素検出溶液（用事調製）

1. 尿素検出溶液A：尿素検出溶液B＝5：1で混合する（検出溶液混合用容器を使用）。
2. 95℃の恒温槽で30分間、加熱する。
3. 十分に冷ましてから軽く攪拌し、尿素検出溶液として使用する。

■尿素標準液

尿素標準液を超純水で2倍の段階希釈にて希釈系列を作製する。
濃度：0（超純水のみ）、2.5、5、10、20、40、80、160 μg/mL

測定方法

※duplicateでのアッセイを推奨します。

1. サンプルおよび標準液 20 μLに、酵素活性化溶液 20 μL、基質溶液 40 μLを加えて混和する。
2. 37℃の恒温器中で1時間静置し、酵素基質反応を行う。
3. 用事調製した尿素検出溶液を 180 μL/well加える。
   ※尿素検出溶液の添加はできるだけ光に当たらないように留意してください。
4. プレートシールでしっかりと密閉し、アルミホイル等で 96wellプレートを遮光する。
5. 遮光下で95℃、2時間加熱する。
6. 加熱後、アルミホイルを外し、UVランプ下で十分な呈色が認められるまで反応を促進させる。
   ※UVランプ下では15分〜1時間で十分な呈色が認められます。自然光や蛍光灯下では1〜2時間程度必要になります。呈色の度合については図2の例を参照。
7. 吸光度を測定する（波長：540 nm）。

標準曲線及びアルギナーゼ活性の計算方法

各濃度の尿素標準液の吸光度をfour-parameter logistic curve fit（4PL）もしくは2次回帰曲線にあてはめて標準曲線を計算します。アルギナーゼ活性（unit/mL）は、37℃の条件で1分間に1 μmolのL-Arginineを1 μmolのL-Ornithineと尿素に変換するものと定義しますので、以下の式で求めることができます。

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