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既知遺伝子配列に隣接する未知配列をPCR法により迅速に単離 APAgene™ GOLD-RTゲノムウォーキングキット

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メーカー名：BIO S&T INC

本キットは、BIO S&T社独自のAPAテクノロジー（特許取得済）により、未知のゲノムDNAを迅速（1日）かつ正確に増幅することができます。PCR法により、既知遺伝子配列に隣接する未知配列を迅速に単離できます。

背景

遺伝子組換え作物作製の研究に有用
例えば遺伝子組換え作物では、導入遺伝子の挿入部位を確認することは安全性を確保するうえで重要な作業であるとされています。遺伝子組換えジャガイモにおける遺伝子の挿入部位の同定では、他社製キットや既存の方法に比べて優秀な成績を示したことが報告されており、本キットは操作時間の短縮のみならず、確実性の面でも優秀な製品でございます。

Cullen D, et. al., (2011) Comparison of DNA walking methods for isolation of transgene- flanking regions in GM potato. Molecular Biotechnology, 49: 19-31.

使用目的

既知遺伝子配列に隣接する未知配列をPCR法により迅速に単離できます。以下に示す広範囲な分子生物学的手法にお使いいただけます。

導入遺伝子（T-DNA、遺伝子トラップ、トランスポゾンを含む）、配列タグ部位（STS）、発現配列タグ（EST）に隣接した未知のゲノム配列の単離
巨大クローンやゲノムDNAから、既知配列に隣接した局所配列を単離
P1, YAC, BAC DNA等巨大クローンのインサート末端のシークエンス
cDNAの未知な5’プロモーター調節領域および3’転写終結領域の単離
一本鎖cDNAの未知な5’および3’ RACE産物の単離

PCR産物はそのままシークエンシング、クローニングを行うか、プローブとして用いることができます。

構成内容

APAgene™ 2X Premix
5X DRT binding mixture
DRT Primer A
DRT Primer B
DRT Primer C
DRT Primer D
UAP-N1 (20 pmol/µL)
UAP-N2 (20 pmol/µL)

＊本キットにはTaqポリメラーゼが付属しておりません。また、既知の配列に対する特異的なプライマー（GSP）もご用意いただく必要がございます。

アッセイ原理

3回のPCR反応により標的配列を増幅します。

primary PCR（2ステップPCR）：初めに、遺伝子特異的プライマー（GSP）を用いたPCR反応により一本鎖DNA断片を合成します。続いて、degenerate random tagging（DRT）プライマー（A～D）を用いて二本鎖DNAとします。
nested PCR（1回目）： 先より内側に設計したGSPとlong universal tagging primer　（UAP-N1）でPCRを行い、非特異的PCR産物の割合を減少させます。
nested PCR（2回目）： さらに内側に設計したGSPとshort universal tagging primer　（UAP-N2）でPCRを行うことで、PCR産物をシークエンシングやクローニングにご使用いただけます。

使用例

100 ngのゲノムDNAをlinear amplificationのテンプレートとして用い、2回のnested PCRを行った際の結果を図1に示す。矢印で示した断片はいずれも特異的であることをシークエンシングで確認した。

図1. ヒトとマウスで4種類のDRTウォーキングプライマーを使用したゲノムウォーキングの泳動結果。レーン1：DRT B（マウス）、レーン2：DRT B（ヒト）、レーン3：DRT D（マウス）、レーン4：DRT D（ヒト）、レーン5：DRT A（マウス）、レーン6：DRT A（ヒト）、レーン7：DRT C（マウス）、レーン8：DRT C（ヒト）。矢印の断片をクローニング、シークエンスした。

参考文献

Kenneth Manning et al., 2006, A naturally occurring epigenetic mutation in a gene encoding an SBP-box transcription factor inhibits tomato fruit ripening, Nature Genetics, 38: 948-522. Des R. Kashyap et al., 2006, A Na⁺:H⁺ Antiporter and a Molybdate Transporter Are Essential for Arsenite Oxidation in Agrobacterium tumefaciens, Journal of Bacteriology, 118: 1577-1584. Lawson Handley, L.J., Perrin, N., 2006, Y chromosome microsatellite isolation from BAC clones in the greater white-toothed shrew (Crocidura russula), Molecular Ecology Notes 60, 276-279. Des R. Kashyap et al., 2006,Complex Regulation of Arsenite Oxidation in Agrobacterium tumefaciens, Journal of Bacteriology, 118: 1081-1088. Landis ED, Palti Y, Dekoning J, et al., 2006, Identification and regulatory analysis of rainbow trout tapasin and tapasin-related genes, Immunogenetics, 58: 56-69. B. S. Sharma et al., 2006, Detection and Characterization of Amplified Fragment Length Polymorphism Markers for Clinical Mastitis in Canadian Holsteins, J Dairy Sci. 89: 3653-63. Yuko Ohta et al., Homologs of CD83 from Elasmobranch and Teleost Fish, The Journal of Immunology, 173: 4553-4560.

APAgene™ GOLD-RTゲノムウォーキングキット

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
APAgene^TM GOLD-RT Genome Walking Kits	BAT	BT901-RT	10 RXN	￥77,000

関連商品～Taq DNA polymerase～

上記キットにはTaqポリメラーゼが付属していないため、お客様でご用意いただく必要がございます。
ここでは、コスモ・バイオがお勧めする、高性能で安価なTaqポリメラーゼをご紹介します。

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
EconoTaq^(R) DNA Polymerase (with Mg++)	LUC	30031-1	1000 UNIT	販売終了
EconoTaq^(R) DNA Polymerase (with Mg++)	LUC	30031-2	5000 UNIT [5 x 1,000 U]	販売終了
EconoTaq^(R) DNA Polymerase (with Mg++)	LUC	30031-3	10000 UNIT [10 x 1,000 U]	販売終了
EconoTaq^(R) DNA Polymerase (separate Mg++)	LUC	30032-1	1000 UNIT	販売終了
EconoTaq^(R) DNA Polymerase (separate Mg++)	LUC	30032-2	5000 UNIT [5 x 1,000 U]	販売終了
EconoTaq^(R) DNA Polymerase (separate Mg++)	LUC	30032-3	10000 UNIT [10 x 1,000 U]	販売終了
Taq DNA Polymerase (PCR)	APB	G009	1000 UNIT [200 ul]	APB社 G009 200 を参照
Taq DNA Polymerase (PCR)	APB	G008	5000 UNIT [1.0 ml]	販売終了
Taq DNA Polymerase (PCR)	APB	G126	10000 UNIT [2 x 1.0 ml]	販売終了