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記事ID : 14117
研究用

高感度な β-Galactosidase 発光測定キットβ-ガラクトシダーゼアッセイ(発光法) ‐RubyGlow™ Glo-Gal™‐

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RubyGlow™ Glo-Gal™ β-ガラクトシダーゼアッセイキットは、β-Gal アッセイとルシフェラーゼ酵素を組み合わせることによって、迅速・簡便・高感度に β-ガラクトシダーゼを測定します。発光を利用しているため、低発現レベルの lacZ 活性も高感度に測定可能です。

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背景

lacZ (β-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子)

分子生物学のアプリケーションで最も一般的に使用されるレポーター遺伝子の一つとして、大腸菌(E.coli)の lacZ 遺伝子があります。lacZ 遺伝子は、in vivo における βガラクトシダーゼ 活性サブユニットをコードします。βガラクトシダーゼ酵素は、通常、哺乳動物、酵母、バクテリア、さらに、植物細胞には存在しないため、非常に低いレベルでも検出することができます。βガラクトシダーゼ酵素はまた、lacZ 発現のモニタリング(すなわち、共発現した遺伝子やプロモーターの活性のモニタリング)のための広い基質特異性を有していて、FACS分析では細胞あたりわずか5コピーのβガラクトシダーゼまで検出できます。βガラクトシダーゼ活性の発色性アッセイ(例.X-Gal 基質の使用)や蛍光性アッセイ(例.FDG(Fluorescein di-β-D-galactopyranoside)基質の使用)は、広範な用途に用いられていますが、より一層高い感度でlacZ活性を検出する場合、発光基質を用いる方法があります。

特長

Marker Gene Technologies(MGT)社のβ-ガラクトシダーゼアッセイキットは、β-Gal アッセイ と高感度ルシフェラーゼ酵素を組み合わせることによって、lacZ 活性を高感度に測定することができます。高感度 Glo-Gal™ 基質は、β ガラクトシダーゼ酵素によって切断され、ATP ルシフェラーゼの存在下で発光シグナルを生成します。キット中のルシフェラーゼ酵素は、赤色発光(λmax = 619 nm)を生成するように遺伝的に改変されています。

構成内容

β-ガラクトシダーゼ検出キットには、200 アッセイ(2×96ウェルマイクロタイタープレート)分の試薬が含まれています。

  • 細胞 ライシスバッファー: 2 x 10ml
  • 反応バッファー: 2 x 10ml
  • Glo-Gal™ 基質: 2 x 15mg
  • RubyGlow™ Red ルシフェラーゼ: 2 x 0.5mg

プロトコール 概要

検量線は、精製β-ガラクトシダーゼ酵素(濃度既知)を使用して調製することを推奨します。

  1. 細胞ライセートの調製
    接着細胞または非接着細胞を標準的な組織培養条件で 70〜80%コンフルエントまで増殖させ、吸引または遠心分離によって細胞試料から培地を除去します。滅菌PBS(1ウェルあたり 50-100uL)で細胞を洗浄し、PBSを除きます。細胞ライシスバッファーを、1ウェルあたり 100uL の量で細胞に加え、30分間 37 ℃でインキュベートします。
  2. アッセイバッファーの調製
    Glo-Gal™ 基質 1バイアルとRubyGlow™ Red ルシフェラーゼ 1バイアルを、10ml の反応バッファーで再溶解します。
  3. 各ウェルのサンプルとスタンダードにアッセイバッファー 100μl を加えます。
  4. 0-10分間インキュベートし、その後発光プレートリーダーで発光を測定します。

測定例

NIH3T3とCre-Bag2 (β-gal 陽性)細胞でのβガラクトシダーゼアッセイ
図1.ルシフェラーゼ活性
NIH3T3 と Cre-Bag2 (β-gal 陽性)細胞を回収し測定した。
細胞懸濁液を、100%、75%、50 %、25%、0% NIH3T3 細胞を含むように調製し、3連で96ウェルプレートに播種した。一晩増殖させ、50uLの細胞ライシスバッファーを加え、30分間インキュベートした。調製したアッセイバッファー50uLを、すべての細胞のウェルと細胞ライシスバッファーのみを含むウェルに添加した。プレートを室温で10分間インキュベートし、テカンインフィニット M200 Pro プレートリーダーで発光を測定した。

β-ガラクトシダーゼアッセイキットのスタンダードカーブ
図2.β-ガラクトシダーゼ検量線
精製 β-ガラクトシダーゼを細胞ライシスバッファー中で 25U/ml 濃度に調製し、1.5U/ml まで連続希釈した。
希釈後のβ-ガラクトシダーゼ溶液 50uL を96ウェルプレートに移し、調製したアッセイバッファー 50μlを添加してプレートをテカンインフィニットM200 Proプレートリーダーで直ちに測定した。

参考文献

  1. Fukuda, S.; Murakami, S.; Tatsumi, H. Recombinant firefly luciferase and their application for the detection of microorganisms. Bioluminescence & Chemiluminescence, Proceedings of the International Symposium, 11th, Pacific Grove, CA, United States, Sept. 6-10, 2000 (2001), Meeting Date 2000, 285-288.
  2. Yang, X., Janatova, J., Andrade, J.D. (2005),"Homogeneous enzyme immunoassay modified for application to luminescence-based biosensors." Analytical Biochemistry 336(1), 102-107.
  3. Bronstein I, Fortin J, Stanley PE, Stewart GS, Kricka LJ. (1994) "Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays." Anal. Biochem. 219: 169.
  4. Geiger R., Schneider E., Wallenfels K., Miska W., (1992) "A new ultrasensitive bioluminogenic enzyme substrate for beta-galactosidase." Biol. Chem. Hoppe Seyler. 373(12):1187-91.

β-ガラクトシダーゼアッセイ(発光法) ‐RubyGlow™ Glo-Gal™‐

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
RubyGlowTM Glo-GalTM β-Galactosidase Assay Kit詳細データ MGT M1968 1 KIT
¥44,000

関連情報

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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