high fidelity PCR に最適なマスターミックス Bioneer社 AccuPower® Hotstart Pfu PCR PreMix

AccuPower® Hotstart Pfu PCR PreMixは、high fidelity PCR用に必要な全ての成分をプレミックスして凍結乾燥したready-to-useのPCRマスターミックスです。プライマーとテンプレートを加えるだけで、再現性の高い結果が得られます。ユニークな酵素によるホットスタートPCR法を用いることで、PCRサイクル前のミスプライム、プライマーダイマーなどの非特異的産物を減少させます。本品の優れた感度、特異性とプルーフリーディング活性で、エラーの少ないPCR産物を得ることができます。

AccuPower® PCR PreMix シリーズ

• high fidelity
  プルーフリーディング活性でDNA増幅時のミスプライムを減少させます（図2）。
• 簡便
  テンプレートとプライマーを加えるだけでPCRがスタートできます。
• 特異性
  Mg²⁺と強い親和性を持つピロリン酸をリアクションミクスチャーに加えることで、DNA ポリメラーゼ活性を阻害し、PCRサイクル前の非特異的産物の形成を防ぎます（図1）。
• 再現性
  Bioneer社の厳格な品質管理生産システムにより、再現性の高い試験結果が得られます。

• 平滑末端の遺伝子クローニング
• 部位特異的変異誘発
• 正確性の高い増幅
• 特異性の高い PCR
• cDNA増幅

• 5' - 3' エキソヌクレアーゼ活性： No
• 3' - 5' エキソヌクレアーゼ活性： Yes
• 3' - A　オーバーハング： No
• フラグメントサイズ： ≧5kb

● 酵素によるホットスタートPCRメソッド

図1　耐熱性ピロホスファターゼによるホットスタート法

● プルーフリーディング活性

図2　Pfu DNA ポリメラーゼのプルーフリーディング活性により正確な増幅産物が得られる

図3　PCR増幅効率の他社ホットスタートPfu PCRマスターミックスとの比較
各社プロトコールに従って試験した。
ターゲット：ヒトインスリンレセプター遺伝子
レーンM：100bp DNA ラダー
レーン1：10ng ヒトゲノムDNA
レーン2：1ng ヒトゲノムDNA
レーン3：100pg ヒトゲノムDNA
レーン4：10pg ヒトゲノムDNA

図4　PCR増幅特異性の他社ホットスタートPfu PCRマスターミックスとの比較
3種類のプライマー-テンプレートを同一条件で増幅した。
反応条件：95℃5分間→95℃30秒、62℃30秒、72℃1分間を35サイクル
DNA量：
レーン1、3、5：100ng
レーン2、4、6：10ng
レーンM：100bp DNA ラダー
レーン1、2：ApoEプライマーセット（268bp）
レーン3、4：PrPプライマーセット（500bp）
レーン5、6：PrPプライマーセット（705bp）

図5　PCR増幅特異性の他社ホットスタートPfu PCRマスターミックスとの比較
p53遺伝子をターゲットとして7種類のプライマーセットで試験した。
反応条件：95℃5分間→95℃30秒、62℃40秒、72℃1分間を32サイクル→72℃5分間
DNA量：10ng
レーンM：100bp DNA ラダー
レーン1：P75/73 プライマーセット（139bp）
レーン2：P55/53 プライマーセット（211bp）
レーン3：P55/63 プライマーセット（447bp）
レーン4：P75/83 プライマーセット（618bp）
レーン5：P55/73 プライマーセット（1082bp）
レーン6：P65/83プライマーセット（1296bp）　
レーン7：P55/83 プライマーセット（1561bp）

図6　AccuPower® Hotstart Pfu PCR PreMixの高い増幅効率
反応条件：95℃5分間→95℃20秒、65℃20秒、68℃15分を35サイクル→68℃5分間
レーンM：1kb DNA ラダー
レーン1：2kb フラグメント（ヒト腫瘍タンパク質p53）
レーン2：2.5kb フラグメント（ヒト腫瘍タンパク質p53）
レーン3：3kb フラグメント（ヒト腫瘍タンパク質p53）
レーン4：4.5kb フラグメント（ヒトDNAクロスリンク修復1A遺伝子）
レーン5：5kb フラグメント（ヒトミトコンドリア遺伝子）

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