次世代シーケンシング｜分子インデックス RNA-Seq / ChIP-Seq ライブラリ調製キット（Illumina 社対応）NEXTflex™ qRNA-Seq™ キット v2

NEXTflex™ qRNA-Seq™ ライブラリ調製キット（Illumina 社対応／特許出願中）は、RNA-Seq による高精度な遺伝子発現解析と、ChIP-Seq による免疫沈降したDNAの定量的な検出を可能にするキットです。セルラーリサーチ社と共同で開発した本キットは、従来のRNA-Seq / ChIP-Seq ライブラリと同等のライブラリを作成するだけでなく、Molecular Index™ （分子インデックス）の付加が特長となっています。PCR増幅ステップの前に、全ての cDNA / ChiP-DNA フラグメントの末端を、ランダムに選択されたユニークな Molecular Index（分子インデックス）を含むアダプターペアにライゲーションします。従来のライブラリ調製では、ユニークなアダプターがライゲーションされた同一のDNA配列と、PCRによる増幅産物とを区別することができませんでしたが、Molecular Index（分子インデックス）を用いることで、両者の区別が可能になります。Molecular Index（分子インデックス）情報を用いた解析により、次世代シーケンシングで多く発生する増幅のノイズに影響されずに、遺伝子発現レベルを絶対量としてデジタル測定することが可能です。

• ユニークな Molecular Index（分子インデックス）を用いて RNA-Seq / ChIP-Seq リードの高精度測定が可能
• メーカー独自の“Enhanced Adapter Ligation Technology”により多数のユニークシーケンシングリードが可能
• インプット量： mRNA もしくは rRNA を除去したトータルRNA 10〜100ng／ChIP-DNA 500 pg
• マルチプレックス解析用のバーコードを最大96種類利用可能
• リキッドハンドラーによる自動化に適したワークフロー
• Illumina® シークエンシングプラットフォームで検証済み

＜特集ページはこちら＞株式会社パーキンエルマージャパン NGS ライブラリ調製キット
 特集：次世代シーケンシング The NGS Experts™

• DNA分子ごとの分子ラベル

本キットには、シーケンシングアダプターの96種類の Molecular Index（分子インデックス）が２セット含まれます。各ラベル（インデックス）は、8ヌクレオチドの Molecular Index（分子インデックス）で構成されています。ライゲーション反応の際、これらの96アダプターは、DNAフラグメントの濃度に対して大過剰量存在するため、 Molecular Index（分子インデックス）が枯渇することはありません。DNAフラグメントの各末端に、Molecular Index（分子インデックス）のプールから、それぞれランダムに1つのラベルが結合することから、両方の末端で 96×96＝9,216 の組み合わせが生じることになります。すべてのクローンについて、ペアエンド法により、ライブラリ配列に隣接する各末端のラベルを解析します。各ライブラリインサートへの Molecular Index（分子インデックス）の付加に加えて、マルチプレックス解析用に、各ライブラリにサンプルバーコードを組み込むことも可能です。

RNAシーケンシングの Molecular Index（分子インデックス）の利用についての詳細はアプリケーションノート（英文PDF） をご参照ください。

図1　mRNA転写物のマッピングの模式図
フラグメント末端の個々の分子インデックスを異なる色で表す。分子インデックスがない場合、cDNAフラグメントの数がわからないが、分子インデックスを用いるとフラグメント数を決定することができる。

• ChIP-Seq に対応

本キット は、ChIP サンプルにもご使用いただけます。NGS（次世代シーケンシング）ライブラリ調製の際に、ChIP サンプルを、ユニークな Molecular Index（分子インデックス）を含むアダプターペアにライゲーションします。Molecular Index（分子インデックス）の付加により、同一のDNA分子とPCRによる増幅産物とを区別することができ、ChIP-seq データの正確な定量解析が可能になります。また、Molecular Index（分子インデックス）は、多型とポリメラーゼのエラーとを容易に区別できるため、一塩基多型（SNP: Single Nucleotide Polymorphism）の研究に適しています。DNAとRNA両方のプロトコールをご用意しております。

• プロトコール

qRNA-Seq

本キットを使用して、mRNA または rRNAを除去したRNAを、陽イオン性バッファーを用いて断片化します。断片化したRNAをファーストストランド、セカンドストランド合成し、エンドリペア、アデニル化後、ライゲーションしてPCR します。

qChIP-Seq

本キットを使用して、ChIP DNAをエンドリペア、アデニル化後、ライゲーションしてPCR します。

• マルチプレックス解析

本キットにはバーコード（Illumina 社対応）が含まれており、別途購入する必要はありません。8反応分のキットには、マルチプレックス解析用に4種類のバーコードが含まれています。48反応分のキットには4つのバージョンがあり、それぞれに24種類の独自のバーコードが含まれています。一度に最大96サンプルのマルチプレックス解析が可能です。

• NEXTflex™ RNA 断片化バッファー
• NEXTflex™ First Strand 合成プライマー
• NEXTflex™ First Strand 合成バッファーミックス
• NEXTflex™ Second Strand 合成ミックス
• NEXTflex™ エンドリペアバッファーミックス
• NEXTflex™ エンドリペア酵素ミックス
• NEXTflex™ アデニル化ミックス
• NEXTflex™ ライゲーションミックス
• NEXTflex™ Molecular Index アダプター
• NEXTflex™ qRNA-Seq™ Universal Forward プライマー
• NEXTflex™ qRNA-Seq™ PCR マスターミックス
• NEXTflex™ qRNA-Seq™ Barcoded プライマー
• ヌクレアーゼフリー水
• 再懸濁バッファー

＜その他 必要な試薬・機械＞

• RNA インプット量： 10 ng - 100 ng　poly(A) RNA enriched または rRNAを除去したトータルRNA
• ChIP DNA インプット量： 500 pg - 100 ng　ChIP DNA

• NEXTflex™ Poly(A) ビーズ (株式会社パーキンエルマージャパン Cat. #512981)
• DynaMag™-2 Magnet (Life Technologies Cat # 123-21D)
• Ribo-Zero™ (Epicentre) または RiboMinus™ (Life Technologies) - rRNA除去用

• SuperScript® III 逆転写酵素 (Life Technologies Cat # 18080-093)

• 100% エタノール（室温）
• 80% エタノール（室温）
• 2、10、20、200、1000 µL ピペット
• RNase フリー ピペットチップ
• ヌクレアーゼフリー 1.5 mL マイクロチューブ
• Thin wall ヌクレアーゼフリー 0.5 mL マイクロチューブ
• 96ウェル PCR プレート（ノンスカート） (Phenix Research, Cat # MPS-499) または同等製品
• PCR プレートシール (BioRad, Cat # MSB1001)
• PCR反応産物精製キット ‐ Agencourt AMPure XP 60 mL (Beckman Coulter Genomics, Cat # A63881)
• 磁気スタンド-96 (Ambion, Cat # AM10027) または同等製品 - PCR反応後のクリーンアップ用
• 微量遠心機
• サーマルサイクラー
• ヒートブロック
• ボルテックス

図2　ライブラリ調製のワークフロー
単離したmRNA（ピンク）を断片化し、ランダムプライマーで逆転写酵素によりcDNA（青）を合成した後、Second Strand を合成。精製後、cDNAの末端をリペア、アダプターをライゲーションできるようにAオーバーハングを付加。cDNAの各末端に、96アダプターのうちの1つ（黒）をライゲート。未反応のアダプターを除去し、得られたcDNAを、シーケンシングアダプター（黄）にある共通のプライマー配列を用い、PCRで増幅。必要に応じて、サンプルバーコードをPCRプライマーに追加することが可能（オレンジ）。

※  表示価格について