次世代シーケンシング｜分子インデックス RNA-seq ライブラリ（ストランド情報あり）調製キット（Illumina 社対応）NEXTflex™ Rapid Directional qRNA-Seq™ キット

NEXTflex™ Rapid Directional qRNA-Seq™ キット（特許出願中）は、RNAシーケンシングによる高精度でディレクショナルな遺伝子発現解析を可能にするキットです。セルラーリサーチ社と共同で開発したこのキットは、従来のRNAシーケンシングライブラリ（ストランド情報あり）と同等のディレクショナルライブラリを作成するだけでなく、Molecular Index™ （分子インデックス）の付加が特長となっています。本キットは、生成されたRNA転写産物がどちらのDNA鎖に由来するかを示す、ストランド情報を得るために使用することが可能です。

• Molecular Index™ （分子インデックス）が付加された RNA-seq ライブラリ（ストランド情報あり）を生成
• 高精度で定量的なRNA発現測定
• メーカー独自の“Enhanced Adapter Ligation Technology”により多数のユニークシーケンシングリードが可能
• インプット量： mRNA もしくは rRNA を除去したトータルRNA 10〜100ng
• インデックス配列を含むマルチプレックス解析用のバーコードを最大96種類ご用意
• リキッドハンドラーによる自動化に適したワークフロー
• Illumina® シークエンシングプラットフォームで検証済み

＜特集ページはこちら＞株式会社パーキンエルマージャパン NGS ライブラリ調製キット
 特集：次世代シーケンシング The NGS Experts™

• DNA分子ごとの分子ラベル

NEXTflex™ Rapid Directional qRNA-Seq キットは、Illumina 社次世代シーケンサー（NGS）に対応する、ストランド特異的なディレクショナルRNAライブラリの調製に使用でき、RNA分子の高精度な測定が可能です。本キットは、従来のストランド特異的なディレクショナル RNA-Seq ライブラリと同等のライブラリを効率的に作成するだけでなく、セルラーリサーチ社が開発した技術である Molecular Indexing™ が特長となっています。本キットには、シーケンシングアダプターの96種類の異なる分子ラベルのセットが含まれます。個々のラベルは、8ヌクレオチドのバーコードタグで構成されています。ライゲーション反応の際、cDNAの各末端に、96アダプターのプールから、それぞれランダムに1つのラベルが結合することから、両方の末端で 96×96＝9,216 の組み合わせが生じることになります。すべてのクローンについて、ペアエンド法により、cDNA 配列に隣接する各末端のラベルを解析します。その結果、同じ分子のリサンプリングと、同じ配列の異なる分子のサンプリングとを区別が可能になります。Molecular Index™ （分子インデックス）情報を用いた解析により、RNAシーケンシングで多く発生する増幅のノイズに影響されずに、遺伝子発現レベルを絶対量としてデジタル測定することが可能です。分子レベルでDNAフラグメントをコード化することに加えて、ライブラリを調製するPCRステップでは、サンプル特異的なバーコードを付加することも可能です。

RNAシーケンシングの Molecular Index™ （分子インデックス）の利用についての詳細はアプリケーションノート（英文PDF） をご参照ください。

図1　mRNA転写物のマッピングの模式図
フラグメント末端の個々の分子インデックスを異なる色で表す。分子インデックスがない場合、cDNAフラグメントの数がわからないが、分子インデックスを用いるとフラグメント数を決定することができる。

• マルチプレックス解析

本キットにはバーコードが含まれており、別途購入する必要はありません。8反応分のキットには、マルチプレックス解析用に4種類のバーコードが含まれています。48反応分のキットには4つのバージョンがあり、それぞれに24種類の独自のバーコードが含まれています。一度に最大96サンプルのマルチプレックス解析が可能です。

• 磁気ビーズによる mRNA 精製

NEXTflex™ Poly(A) ビーズを使用することで、RNA-Seq ライブラリ調製用に、高純度でインタクトな mRNA を精製できます。このビーズは、オリゴ（dT）プライマーを用いて、予め単離された 1〜10μg のトータルRNAから、ポリアデニル化された mRNA を単離します。

• NEXTflex™ RNA 断片化バッファー
• NEXTflex™ First Strand 合成プライマー
• NEXTflex™ Directional First Strand 合成バッファーミックス
• NEXTflex™ Rapid 逆転写酵素
• NEXTflex™ Directional Second Strand 合成ミックス
• NEXTflex™ アデニル化ミックス
• NEXTflex™ ライゲーションミックス
• NEXTflex™ Directional qRNA Molecular Labels (1 µM)
• NEXTflex™ ウラシル DNA グリコシラーゼ
• NEXTflex™ qRNA-Seq™ Universal Forward プライマー (10 µM)
• NEXTflex™ PCR マスターミックス
• NEXTflex™ qRNA-Seq™ Barcoded プライマー 1-4 (10 µM)
• ヌクレアーゼフリー水
• 再懸濁バッファー

＜その他 必要な試薬・機械＞

• 10 - 100 ng poly(A) RNA enriched または rRNA を除去したトータル RNA
• 100% エタノール（室温）
• 80% エタノール（室温）
• 2、10、20、200、1000 µL ピペット
• RNase フリー ピペットチップ
• ヌクレアーゼフリー 1.5 mL マイクロチューブ
• Thin wall ヌクレアーゼフリー 0.5 mL マイクロチューブ
• 96ウェル PCR プレート（ノンスカート） (Phenix Research, Cat # MPS-499) または同等製品
• PCR プレートシール (BioRad, Cat # MSB1001)
• PCR反応産物精製キット ‐ Agencourt AMPure XP 60 mL (Beckman Coulter Genomics, Cat # A63881)
• 磁気スタンド-96 (Ambion, Cat # AM10027) または同等製品
• 微量遠心機
• サーマルサイクラー
• ヒートブロック
• ボルテックス

図2　NEXTflex™ Rapid Directional qRNA-Seq　フローチャート

※  表示価格について