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生細胞数をプレートリーダーで簡単比色測定 XTT 生細胞数測定キット

メーカー名：Biotium, Inc.

XTT 生細胞数測定キットは、標準的なマイクロプレートリーダーを使って、簡単に生細胞数を測定するためのキットです。

背景

生細胞数の測定は、多くの場合細胞増殖速度の調査や細胞毒性試薬のスクリーニングの目的で使用されます。XTTは、テトラゾリウム誘導体で、MTTと同様に、生細胞中のミトコンドリア酵素活性（XTTを消費し、細胞死の直後に不活性化される）に基づいて、生細胞数を測定します。MTTからできるホルマザンが水に不溶性であるのに対し、XTTは非常に水に溶けやすいオレンジ色の色素になることから、MTTの分析で必要な可溶化ステップを省略することができます。XTTからできる水溶性色素の量は、サンプル中の生細胞の数に比例し、475nmにおける波長を測定することで、定量化することができます。

構成内容

XTT溶液
活性化試薬 PMS

操作概要

96ウェル組織培養プレートに細胞を播種します。一般的に、48-72時間以内に最適密度に達するには、1ウェルあたり5000から10000細胞数の間で播種します。
NOTE：代謝活性の低い細胞種（リンパ球、ケラチノサイト、メラノサイトなど）では、1ウェルあたり2.5×10⁶細胞まで密度を上げることを推奨します（相当時間内に適切なフォルマザンの発色を得るため）。
必要な細胞処理を行います。各ウェル内の培地の最終容量が100μLとなるようにしてください（培地中の血清濃度は最大10％まで）。
使用の直前に反応溶液を調製します。XTT溶液中に沈殿物がある場合は、37℃に加温し、溶液が澄明になるまで穏やかに振り混ぜます。5mLのXTT溶液に25μLの活性化溶液を加え、XTT溶液を活性化させます。容量は、必要に応じて調整してください。
活性化させたXTT溶液（反応溶液）25μL又は50μLを各ウェルの培地（100μL）に加えます。 NOTE：活性化XTT溶液50μLを添加した場合、シグナルがシャープに検出されますが、25μL添加した場合に比べて、少ない細胞数でシグナルが飽和に達します。25μL添加では、検出範囲がより広くなります。各ウェル中の培地が100μLより多い場合は、添加する活性化溶液の量も増やしてください。例：成長培地200μLに対して、反応溶液100μLを添加
プレートを2-24時間インキュベートします（通常は2-5時間で十分です）。
NOTE：反応溶液とのインキュベート時間は、細胞の種類や濃度によって異なります。従って、最初の試験を行う場合は、複数の時間で測定することが望ましいです。例：同じプレートについて、4、6、8、12時間後に測定
プレートを穏やかにゆすり、ウェル内の色素を均一にします。
分光光度計の波長450-500nmで、サンプルの吸光度シグナルを測定します。630-690nmにおける吸光度もバックグランドとして測定します。シグナルの吸光度からバックグランドの吸光度を差し引き、吸光度値を補正します。