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記事ID : 12399
研究用

HRE結合性の活性型をELISAベースで測定HIF-1α DNA 結合活性アッセイ

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HIF-1α DNA 結合活性アッセイは、低酸素応答性配列(HRE)に結合性を持つ活性型HIF-1 を測定します。

本アッセイでは、HRE配列を含むビオチン標識二本鎖DNAをストレプトアビジンコートプレートの各ウェルに結合後、タンパク質サンプルを添加します。短時間インキュベートした後、抗HIF-1α抗体、続いてHRP標識二次抗体を添加します。分光測定法による簡単な比色検出が可能になります(測定波長:450nm)。

背景

HIF-1αとは

哺乳動物細胞は、低酸素状態の感知することができ、低酸素応答性の一連の遺伝子をオンにします。

低酸素誘導因子 HIF-1(hypoxia-inducible factor 1)は、VEGFやエリスロポエチン(erythropoietin)を含むいくつかの低酸素応答性遺伝子の活性化に関与します。HIF-1複合体は、HIF-1b/ARNT とHIF-1 Alpha(HIF-1α)の2つのタンパク質サブユニットから構成されます。HIF-1α は、正常な酸素条件下では継続的にユビキチンプロテアソーム系(UPS)によって分解されるため、検出されません。一方、低酸素条件下では、HIF-1α は安定化・蓄積し、細胞質から核へ移行後にHIF-1b/ARNTと二量体化して転写活性を示します。HIF-1複合体は、低酸素応答性領域(HREs:hypoxic response elements)に作用し、遺伝子発現を誘導する転写コアクチベーターを結合します。HIF-1 の安定性と機能の厳格な制御は、翻訳後修飾(ヒドロキシル化、ユビキチン化、アセチル化、およびリン酸化など)によって調整されます。

通常の酸素条件下においてHIF-1αの翻訳後修飾は、N末端トランス活性化領域、C末端トランス活性化領域、酸素依存的分解領域(ODDD:oxygen dependent degradation domain)で発生します。2つのプロリン残基のヒドロキシル化およびODDD中リジン残基のアセチル化は、HIF-1と von Hippel-Lindau (pVHL) ubiquitin E3 ligase complexの結合を促進します。pVHL complexはHIF-1をユビキチン化修飾し、26Sプロテアソームによって分解します。また、C末端トランス活性化領域中のC末端のアスパラギン残基のヒドロキシル化は、HIF-1とCBP/p300 との相互作用をブロックするため、HIF-1 転写活性が阻害されます。HIF-1αが合成されると、2-オキソグルタル酸ジオキシゲナーゼによって402番目と564番目のプロリン残基が急速にヒドロキシル化されます。これらのジオキシゲナーゼ(proline hydroxylase domains (PHDs))が低酸素または化学的に不活性化されると、HIF-1αの半減期が増加し、続く複合体の活性化をもたらします。

特長

  • HIF-1 DNA 結合活性アッセイは、たった4時間半で終了
    (標準的なゲルシフトアッセイ(EMSA)では3日)
  • ヒト、マウス、ラットのタンパク質サンプルから活性型HIF-1複合体を検出するELISAベースのアッセイ

構成内容

  • 96ウェル ストレプトアビジンコートプレート
  • ビオチン標識二本鎖DNA
  • 抗HIF-1 α抗体
  • DNA結合バッファー
  • 熱変性仔ウシ胸腺DNA(100X)
  • HRP標識二次抗体
  • アッセイ希釈液
  • 10X 洗浄バッファー
  • 基質溶液
  • 停止溶液

使用例

HIF-1 αの検出特異性
図1.HIF-1 αの検出特異性

ほぼコンフルエントなHeLa細胞を、0.2 mM デフェロキサミンメシレート(DFO)存在/非存在下で、37℃・4時間培養した。細胞をトリプシン処理し、セルバイオラボ社 核/細胞質分画キット(品番:AKR-171)を使用して核抽出物を調製した。 ビオチン標識されていない野生型または変異型の低酸素応答配列(HRE)二本鎖コンペティターオリゴ(非売品)各100 pmolを、ウェル添加直前にDNA結合バッファーに加えた。核抽出物 20 μgを各ウェルに添加し、アッセイプロトコールに従ってELISAを行った。

HIF-1α DNA 結合活性アッセイ

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
HIF-1α DNA Binding Activity Assay Kit詳細データ CBL CBA-282 96 ASSAY
¥104,000

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