哺乳類細胞のタンパク質抽出・分離に有用 核／細胞質 分画キット

核／細胞質分画キット（Nuclear/Cytosolic Fractionation Kit）は、哺乳類細胞の核タンパク質と細胞質タンパク質を分離するための迅速で簡便なキットです。

核／細胞質 分画キットは哺乳類細胞の細胞質画分から核抽出物を分離する簡便・迅速なツールです。最適化されたプロトコールにより、2時間以内でコンタミネーションの少ないタンパク質を効率良く回収できます。

抽出した画分は DNA フットプリンティング、pre-mRNA スプライシング、ゲルシフトアッセイ（EMSA）、レポーターアッセイ、酵素活性アッセイおよびウエスタンブロットのようなダウンストリームアッセイに適しています。

• 哺乳動物細胞の細胞質画分から核抽出物を分離する簡便・迅速なツール
• 2時間以内で抽出完了
• 各プレップあたり、5 x 10⁶ 細胞まで対応

• 細胞質抽出バッファー　（CEB：Cytosol Extraction Buffer）
• 細胞溶解試薬
• 核抽出バッファー
• ジチオスレイトール（DTT）
• プロテアーゼインヒビター

I．細胞質を抽出

1. 最大 5 x 10⁶ の細胞を5分間遠心して回収（4ºC，600 x g）
2. 氷冷PBSで細胞を1回洗浄
3. 上清を捨てる
4. 500 µL の氷冷 1X 細胞質抽出バッファー（CEB）（DTT/Protease Inhibitorsを含む）で細胞を再懸濁
5. 予冷した遠心チューブに移す
6. 氷上で10分間インキュベート
7. 細胞溶解試薬25μLを添加し、10秒間ボルテックス
8. 10分間遠心（4ºC，800 x g）
9. 予冷した遠心チューブに、上清（細胞質画分）を移す。
   （細胞質画分は、-80℃で保存できます。）
10. ペレットを 500 µLの氷冷 1X 細胞質抽出バッファー（CEB）（DTT/Protease Inhibitorsを含む）で再懸濁
    NOTE:この洗浄操作は、画分間のクロスコンタミネーションを低減するためのステップです。
11. 細胞溶解試薬25μLを添加し、10秒間ボルテックス
12. 10分間遠心（4ºC，800 x g）
13. 上清をアスピレート除去

II．核タンパク質を抽出

1. 100 µL の氷冷 1X 核タンパク質抽出バッファー（DTT/Protease Inhibitorsを含む）で細胞を再懸濁
2. 氷上で30分間置き、10分毎に10秒間ボルテックス
3. 30分間遠心（4ºC，14000 x g）
4. 予冷した遠心チューブに、上清（核タンパク質画分）を移す。
   （抽出画分は、-80℃で保存できます。）
   NOTE:核タンパク質抽出物の典型的収量は > 1 mg/mL です。より高い濃度の抽出物が必要な場合、ステップ1の核ペレットの懸濁量を小さくしてください。（最小25μl）

HEK293細胞の分画：
全細胞（W）、細胞質（C）、核(N)画分を Tubulin 抗体（細胞質特異的）と Lamin A/C 抗体（核特異的）でイムノブロットした。

HEK293細胞のトリパンブルー染色：
HEK293（Embryonic Kidney 293）細胞を分画プロトコールの各ステップでトリパンブルー染色を行った。
（未処理細胞、低張液の細胞質抽出バッファー／CEBで再懸濁した細胞、CEB処理後に細胞溶解試薬を処理した細胞）。
完全な細胞溶解および高い核回収率を示している。

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