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研究用

リン酸化タンパク質精製キット(Phosphoprotein Purification Kit)

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リン酸化タンパク質精製キットは、多様なサンプル(血清、血漿、細胞・組織ライセートなど)からリン酸化タンパク質を精製および濃縮するための、迅速で効率的なシステムです。

リン酸化タンパク質は、リン酸化タンパク質精製マトリックスを用いて シングルステップでライセートからアフィニティー精製されます。各プレップは、4時間で総タンパク質ライセート2.5mg(コンフルエント 100 mm ディッシュ一枚分) を処理することができます。

背景

リン酸化タンパク質の検出

タンパク質リン酸化-脱リン酸化は、タンパク質の機能的特性を調節するための主要なシグナル伝達機構の一つで、遺伝子発現、細胞接着、細胞周期、細胞増殖・分化に関与します。プロテインキナーゼによってタンパク質中の特定のセリン、スレオニン、またはチロシン残基がリン酸化されます。また、ウェスタンブロッティングにおける抗リン酸化タンパク質抗体の利用は、シグナル伝達研究分野で一般的に使用されるツールとなっています。しかし残念なことに、細胞溶解物中で発現の低い内因性リン酸化タンパク質は、抗体を高濃度で処理したり長時間露光しても、しばしば検出することができません。したがって、細胞タンパク質中の約10%のリン酸化タンパク質を、精製・濃縮することは有効な手法です。

特長

  • 細胞ライセートからリン酸化タンパク質をシングルステップでアフィニティ精製
  • 1回あたり2.5mg トータルライセートタンパク質(約10cmディッシュ1枚分)からの抽出が可能
  • 操作時間は約4時間

構成内容

  • リン酸化タンパク質濃縮マトリックス
  • マトリックス洗浄液(5×)
  • ライシスバッファー(2×)
  • ローディングバッファー(3×)
  • 溶出バッファー

アッセイプロトコール

I.リン酸化タンパク質濃縮マトリックス の調製
  1. リン酸化タンパク質濃縮マトリックス をボルテックスで再懸濁します。
  2. マイクロ遠心チューブに再懸濁したマトリックス100μlを分注します。
  3. 10,000 x g で5分間遠心。
  4. ペレットを崩さないように上清をアスピレートします。
  5. 1 mL の 1X マトリックス洗浄溶液 を添加し、ボルテックスで再懸濁します。
  6. 10,000 x g で5分間遠心。
  7. ステップ 4-6 を繰り返します。
  8. ペレットを崩さないように上清をアスピレートします。
  9. 1 mL の 1X ローディングバッファー をペレットに添加し、ボルテックスで再懸濁します。
  10. 10,000 x g で5分間遠心。
  11. ステップ 8-10 を繰り返します。
  12. 最後の洗浄後、ビーズをペレットにし、慎重にすべての上清を除去します。
  13. 50 µL の1X ローディングバッファー をペレットに添加します。
II.リン酸化タンパク質の濃縮
  1. リン酸化タンパク質サンプルの濃度を決定(BCAアッセイ)し、1X ライシスバッファー で濃度を 1 mg/mL にあわせます。
  2. 50 mLのコニカルチューブに最大2.5 mg(or 2.5 mL at 1 mg/mL)のライセートサンプルを移します。
  3. 1X ローディングバッファー で10倍希釈します。(終濃度 0.1 mg/mL)
    (例.2.5 mL サンプルを 1X ローディングバッファーでトータル量 25 mL にする。)
  4. 洗浄した リン酸化タンパク質濃縮マトリックス (ステップ13)をボルテックスで再懸濁します。
  5. 100 µL の再懸濁マトリックスをすばやくリン酸化タンパク質溶液に添加します。
  6. 撹拌しながら、4°Cで2時間混合
  7. 1,500 x g で5分間遠心
  8. ペレットを崩さないように上清をアスピレートします。
  9. 1 mL の 1X ローディングバッファー をペレットに添加しボルテックス後、マイクロ遠心チューブに移します。
  10. 10,000 x g で5分間遠心
  11. ペレットを崩さないように上清をアスピレートします。
  12. 1 mL の 1X ローディングバッファー をペレットに添加しボルテックスで再懸濁します。
  13. ステップ10-12を2回繰り返します。
  14. 最後の洗浄後、ビーズをペレットにし、慎重にすべての上清を除去します。
  15. キャプチャーされたリン酸化タンパク質を 0.5 mLの 溶出バッファー で溶出します。
  16. 10分間、室温でオービタルシェイカーを用いて混合します。
  17. 溶出画分を 10,000 x g 5分間の遠心で回収します。
  18. 慎重に上清を回収します。

使用例

p-ERKの濃縮
図1.p-ERKの濃縮
HeLa cell lysateの濃縮をリン酸化タンパク質濃縮マトリックスを用いてインキュベートした。
p-ERK濃縮は、イムノブロットによって確認した。

リン酸化タンパク質精製キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Phosphoprotein Purification Kit詳細データ CBL AKR-106 5 PREP.
¥77,000
Phosphoprotein Purification Kit詳細データ CBL AKR-105 2 PREP.
¥44,000

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