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研究用

Cdc25C基質を用いた、簡単で迅速なアッセイチェックポイントキナーゼ測定キット

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精製したキナーゼ、細胞のライセート、免疫沈降物等のチェックポイントキナーゼサンプルと基質をインキュベートした後、抗リン酸化Cdc25C(Ser216)抗体を用いたウェスタンブロットにより、リン酸化されたCdc25Cを検出します。

背景

Cdc25Cについて

Cdc25Cはタンパク質脱リン酸化酵素であり、Cdc2を脱リン酸化し活性化させます。これは真核細胞における有糸分裂の制御において重要な現象です。

Cdc25Cは間期の間、c-TAK1(Cdc25C associated protein kinase)により恒常的にSer216 のリン酸化を受けており、このリン酸化はG2/M チェックポイントでのDNA 損傷の有無に依存して行われます。有糸分裂に先立って、チェックポイントキナーゼであるCHK1とCHK2はDNA 損傷(Cdc25C のSer216 のリン酸化)に応答して活性化され、最終的に細胞周期が停止します。以上のように、通常であればチェックポイント機構によって、娘細胞へのDNA 損傷の伝播が防がれていますが、これらのチェックポイントキナーゼに変異が入ると、損傷DNA修復機能が低下し、細胞の癌化の可能性が高くなります。

特長

  • チェックポイントキナーゼ基質としてCdc25Cリコンビナントタンパク質を利用
  • 精製したキナーゼ、細胞のライセート、免疫沈降物等のチェックポイントキナーゼサンプルと基質をインキュベートした後、抗リン酸化Cdc25C(Ser216)抗体を用いたウェスタンブロットにより、リン酸化されたCdc25Cを検出(図1)
  • 簡単で迅速なチェックポイントキナーゼ活性のモニターが可能
  • ポジティブコントロールとして活性型CHK1をご用意

構成内容

  • チェックポイントキナーゼ基質(Cdc25Cリコンビナントタンパク質)
  • キナーゼバッファー(10×)
  • ATP溶液
  • 抗リン酸化Cdc25(Ser216)抗体
  • ヤギ抗ウサギ二次抗体(HRP標識)
  • 活性型CHK1(ポジティブコントロール)

アッセイ原理

チェックポイントキナーゼ測定キットのアッセイ原理
図1 アッセイ原理

測定例

アッセイ結果例(CHK1活性免疫ブロットアッセイ)
図2 アッセイ結果例(CHK1活性免疫ブロットアッセイ)
10ng の活性型CHK1を含有する25μl のキナーゼバッファー(1×)と、ATP(0.2mM、8μg)、キナーゼバッファー(1×)(Cdc25Cリコンビナントタンパク質を含有、50μl )を30℃で60 分インキュベートした。キナーゼ反応はSDSPAGEサンプルバッファー(4×)(25μl )を添加して停止させた。
レーン1:キナーゼ添加なし(ネガティブコントロール)
レーン2:キナーゼ添加
Cdc25C 基質のリン酸化は抗リン酸化Cdc25C(Ser216)抗体によりプロトコールに沿って検出した。

チェックポイントキナーゼ測定キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Checkpoint Kinase Activity Immunoblot Kit詳細データ CBL STA-413 20 ASSAY
販売終了

【関連商品】 96-well チェックポイントキナーゼ活性測定キット

チェックポイントキナーゼ(CHK1とCHK)によるCdc25C(Ser216)のリン酸化を検出するためのELISAキットです。チェックポイントキナーゼインヒビターのスクリーニング等にご使用いただけます。

96-well チェックポイントキナーゼ活性測定キット プロトコール

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
96-well Checkpoint Kinase Activity Assay Kit詳細データ CBL STA-414 96 ASSAY
¥122,000
96-well Checkpoint Kinase Activity Assay Kit詳細データ CBL STA-414-5 5*96 ASSAY
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