記事ID ： 43741

安定化２本鎖を有する強力なマイクロRNA阻害核酸 CL-AMO, anti-microRNA oligonucleotides

カテゴリから探す > 分子生物 > その他遺伝子操作

マイクロRNA（miRNA）は18～23塩基の内在性ノンコーディングRNAの一種で、メッセンジャーRNA（mRNA）の非翻訳領域に結合して遺伝子発現の制御を担っています^{1, 2}。様々な遺伝子がmiRNAによる制御を受けるため、miRNAは様々な疾患とも密接に関わっています^{3, 4}。Anti-miRNA oligonucleotide（AMO）は標的miRNAと相補的な配列（アンチセンス配列）を有し、miRNAに結合してその機能を抑制する人工核酸です。細胞内の核酸分解酵素に対する耐性を獲得させるために、一般的にAMOには様々な化学修飾や二次構造が導入されています。

キットイメージ

CL-AMO（Cross-Linked duplexes modified Anti-MicroRNA Oligonucleotides）は、クロスリンクして安定化させた２本鎖（CL）をアンチセンス配列の両末端に接続した構造を持ち、従来のAMOに比べて非常に強力なAMOです⁵。他のAMOに比べて遥かに高い細胞内安定性とmiRNA阻害効果を有しており^{6, 7}、一般的に抑制効果が現れにくいとされる低発現miRNAにも効果的（図3）です。

本製品は、国立研究開発法人　産業技術総合研究所との共同研究により開発しました。

特長

細胞内で高い安定性
高い標的miRNA特異性
高い標的miRNA結合力

細胞内で長期間安定的に作用

細胞のがん化と深く関係するmiR-21を標的とする CL-AMO（品番：CLAM-H21-5)を乳がん細胞株（MCF-7、ZR-75-1）にトランスフェクションし（終濃度：10 nM）、細胞増殖変化をWST-8法により測定しました。CL-AMOは9日間にわたって安定的に細胞増殖を抑制しました（図1A、B）⁶。

図1.
miR-21を標的とするAMOを終濃度が10 nMとなるようにトランスフェクションしたMCF-7細胞(A)およびZR-75-1細胞(B)の細胞数の変化。トランスフェクションした日を１とした相対値で表示。

高い標的特異性

MCF-7細胞に、miR-21を標的とするCL-AMO（品番：CLAM-H21-5)またはランダム配列を有するネガティブコントロールCL-AMO（品番：CLAM-NC1)をそれぞれトランスフェクションし（終濃度：20 nM）、細胞増殖変化をWST-8法で測定しました。miR-21を標的としたCL-AMOのみが増殖抑制効果を示しました（図2）⁶。

図2.
miR-21を標的とするCL-AMOまたはネガティブコントロールCL-AMOをMCF-7細胞に終濃度が20 nMとなるようにトランスフェクションした場合の細胞数の変化。トランスフェクションした日を１とした相対値で表示。

低発現miRNAにも効果的

一般的に低発現miRNAの抑制効果は検出しにくいと考えられています。乳がん細胞における発現量が少ないとされるmiR-148aを標的とする様々なAMOをMCF-7細胞にトランスフェクションしたところ、CL-AMOのみが低濃度でも増殖抑制を示しました（図3）⁷。

図3.
miR-148aを標的とするAMOを終濃度が20 nMもしくは200 nMとなるようにトランスフェクションしたMCF-7細胞の細胞数の変化。トランスフェクションした日を１とした相対値で表示。

2021年論文発表しました！
従来のAMOでは解らなかったmiRNAの機能を、CL-AMOが明らかにしました。

『Stable duplex-linked antisense targeting miR-148a inhibits breast cancer cell proliferation』
Okumura et al., Scientific Reports 11, 11467 (2021)

類似miRNAを見分ける高い標的特異性

miRNAには類似した配列を持つものが多く存在するため、正しい標的miRNAのみを特異的に阻害することが重要です。miR-148aを標的とするCL-AMO、配列の一部にミスマッチを含むCL-AMO、さらにmiR-148aと類似したmiRNAであるmiR-148bを標的とするCL-AMOをMCF-7細胞にトランスフェクションしたところ、miR-148aと完全に相補なCL-AMOのみが増殖抑制を示しました（図4）⁷。
CSR_CL-AMO_Fig4
図4.
各CL-AMOの終濃度が20 nMとなるようにトランスフェクションしたMCF-7細胞の細胞数の変化。トランスフェクションした日を１とした相対値で表示。

参考文献

Fabian, M. R., Sonenberg, N. & Filipowicz, W. Regulation of mRNA Translation and Stability by microRNAs. Annu. Rev. Biochem. 79, 351-379 (2010).
Bartel, D. P. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell 136, 215-233 (2009).
Li, Y. & Kowdley, K. V. MicroRNAs in Common Human Diseases. Genomics, Proteomics Bioinforma. 10, 246-253 (2012).
Ardekani, A. M. & Naeini, M. M. The role of microRNAs in human diseases. Avicenna J. Med. Biotechnol. 2, 161-179 (2010).
Mie, Y. et al. Function Control of Anti-microRNA Oligonucleotides Using Interstrand Cross-Linked Duplexes. Mol. Ther. - Nucleic Acids 10, 64-74 (2018).
Okumura, S., Hirano, Y. & Komatsu, Y. Inhibition of breast cancer cell proliferation with anti-microRNA oligonucleotides flanked by interstrand cross-linked duplexes. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 39, 225-235 (2019).
Okumura, S., Hirano, Y. & Komatsu, Y. Stable duplex-linked antisense targeting miR-148a inhibits breast cancer cell proliferation, Scientific Reports 11, 11467 (2021).