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遺伝子ノックアウト実験用のグルタミン酸作動性ニューロン、ミクログリア CRISPR-Ready ioCells | Bit Bio社

メーカー名：Bit Bio Limited

遺伝子ノックアウト実験用のグルタミン酸作動性ニューロン、ミクログリア

ioCells™は、Bit Bio社独自の「opti-ox」技術を使用して作製された、ヒトiPS細胞由来の神経細胞、グリア細胞、骨格筋細胞です。ioCells™シリーズに、遺伝子ノックアウト実験用のグルタミン酸作動性ニューロン、ミクログリアが加わりました。最適化されたプロトコールで、ioCells™での遺伝子ノックアウト実験を行っていただけます。

CRISPR-Ready ioGlutamatergic Neurons
CRISPR-Ready ioMicroglia (Male)

ヒトiPS細胞由来細胞　ioCells シリーズはコチラ

特長

一貫性のある遺伝子ノックアウト実験が可能
培養とguide RNA導入プロトコールを最適化済み
細胞播種後、数日のうちに遺伝子ノックアウト実験が可能
CRISPRスクリーニングにスケールアップ可能

図　実験の流れ

CRISPR-Ready ioGlutamatergic Neurons

細胞播種後、数日で使用可能

CRISPR-Ready ioGlutamatergic Neurons は凍結細胞として提供され、推奨培地を用いて培養することで急速に成熟します。細胞を播種後、4日間の安定化、ニューロンを成熟させるメンテナンス培養を行います。gRNAは、day 1 からday 3の間（安定化の期間）で導入し、数日のうちに実験に使用可能です。

標的遺伝子のノックアウト効率

図アンプリコンシーケンス解析によるノックアウト効率の評価
CRISPR-Ready ioGlutamatergic Neuronsに、レンチウイルスまたは脂質ベースのトランスフェクション試薬（Lipofectamine RNAiMAX）を用いてSOX11遺伝子を標的とするgRNAを導入した。gRNAは、細胞播種後1日目もしくは3日目に導入した。gRNA導入から3日後、DNAを抽出し、アンプリコンシーケンス解析を行った。どちらの導入方法でも、十分なノックアウト効率を確認した。遺伝子を標的としないgRNAをコントロールとして使用した。

CRISPRスクリーニング

図プール型CRISPRノックアウトスクリーニングによる神経変性疾患関連遺伝子の解析
プール型CRISPRノックアウトスクリーニング用に、神経変性疾患に関連する100種類の既知遺伝子を選択した。CRISPR-Ready ioGlutamatergic Neuronsを播種後3日目に、レンチウイルスによりgRNAを導入し、12日目にシングルセル遺伝子発現解析を行った。その後、シングルセルを、UMAPおよびshared nearest neighbor法を用いてクラスタリングした。AARS1, HARS1, CARS1, GARS1遺伝子等のaminoacyl-tRNA synthetase (aaRSs) ノックアウトのクラスターが検出された。対照的に、遺伝子を標的としないコントロールgRNAは広く分布していた。パスウェイ解析では、aaRSsを標的とするgRNAは小胞体ストレス応答 (unfolded protein response; UPR) を活性化することを示した。

遺伝子ノックアウト実験用ヒトiPS細胞由来グルタミン酸作動性ニューロン

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
CRISPR-Ready ioGlutamatergic Neurons	BIT	IO1090S	1 VIAL [>1 x 10^6 viable cells]	お問い合わせ

CRISPR-Ready ioMicroglia (Male)

細胞播種後、数日で使用可能

CRISPR-Ready ioMicroglia (Male) は凍結細胞として提供され、推奨培地を用いて培養することで急速に成熟します。細胞を播種後、24時間の安定化、9日間の成熟、メンテナンス培養を行います。gRNAは、day 1 からday 18の間で導入し、導入から5日のうちで実験に使用可能です。タンパク質レベルでノックアウトを検出できるか否かは、標的とそのタンパク質の半減期の両方に影響されるため、検出のタイムポイントは、標的タンパク質に合わせて調整する必要があります。

標的遺伝子のノックアウト効率

図フローサイトメトリー解析によるノックアウト効率の評価
CRISPR-Ready ioMicroglia (Male) に、レンチウイルスまたは脂質ベースのトランスフェクション試薬（Lipofectamine RNAiMAX）を用いてbeta-2 microglobulin (B2M) 遺伝子を標的とするgRNAを導入した。gRNAは、細胞播種後10日目に導入した。gRNA導入から5日後、フローサイトメトリー解析を行った。(A) レンチウイルスによるB2M gRNA導入: 20%の細胞にgRNAが導入された (GFPの発現で評価)。(B) GFP陽性細胞のうち86%でB2Mノックアウトが確認された。(C) 脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いた群では、約82%でB2Mノックアウトが確認された。

CRISPRスクリーニング

図シングルセルCRISPRスクリーニングによるミクログリア活性化調節因子の解析
CRISPR-Ready ioMicroglia にLPSを処理し、未処理群と比較し遺伝子発現の変化があった258種類の遺伝子を同定した。別途、神経変性および神経炎症に関連する110種類の候補遺伝子を選択した。これらの遺伝子についてgRNAを用意し、播種後10日目のCRISPR-Ready ioMicrogliaにレンチウイルスを用いてgRNAを導入した。細胞を培養、LPS (+/-) を処理し、24時間後にシングルセルを回収した (day 15)。コサイン類似度の分析では、LPS 処理した CRISPR-Ready ioMicroglia のノックアウト細胞を、休止状態と活性化状態の両方と比較し、17種類の遺伝子がLPS刺激に対する応答に影響を及ぼすことを示した。コサイン類似度0.3以上（任意のしきい値）の遺伝子ノックアウトについてのLog2FCプロファイルをヒートマップ表示した。CD14, MAP3K7, TIRAP, IKBKG, TRAF6, IKBKB, LY96, TICAM1, RELA, TLR4 などのTLR4シグナル伝達経路を介したLPS刺激に関与する遺伝子が検出された。