商品情報

記事ID : 12575
研究用

独自のNickaseNinja All-in-One ベクターでCRISPR-Cas9 技術を用いたゲノム編集をさらに簡単に!ATUM社 CRISPR-Cas9 Genome Engineering/All-in-One NickaseNinja™ vector

このエントリーをはてなブックマークに追加

 

CRISPR/Cas9 Genome Engineering

独自のNickaseNinja All-in-One ベクターでCRISPR-Cas9 技術を用いたゲノム編集をさらに簡単に!

ゲノム編集(Genome Editing)とは、CRISPR-Cas システムやTranscription Activator-Like Effector Nucleases(TALEN)等の技術により遺伝子特異的な破壊やレポーター遺伝子のノックイン等を行う新しい遺伝子改変技術です。

ATUM社(旧DNA2.0社)では、CRISPR-Cas9 ベクター、試薬、gRNAデザインソフトを含む、ゲノム編集操作用ツールセットを開発しました。画期的な NickaseNinja™ は、単一ベクターから2つのgRNAをタンデム発現し、本品1つで全操作が完了するAll-in-One ベクターです。CRISPR-Cas9 技術の利用により複雑なゲノムを的確に改変することが可能です。DNA社は、無料でご利用頂けるgRNAデザインツールをWEB上にご用意しており、(https://www.dna20.com/eCommerce/cas9/input)これを用いてgRNAをデザインし、Electra™-CRISPR ベクターにクローニングします。

特長

CRISPR-Cas9 技術

> 特定領域への遺伝子挿入

> 特定部位における遺伝子発現のノックアウト

> 簡便: Electra™システムでgRNA のカセットクローニング E.coli、酵母、および哺乳類細胞ゲノムに対応

NickaseNinja(TM)オールインワンベクター

NickaseNinja™オールインワンベクター

> 高精度、オフターゲット効果を低減

> 簡便、単一ベクターの形質転換

> Nikase ベクターへのタンデムgRNA クローニング

> 2A-結合型レポータより選択: DasherGFP, PaprikaRFP、レポータなし

> 最小限のオフターゲット効果

CRISPR/Cas9 システム作用機序概要
図1. CRISPR-Cas9 システム作用機序概要

CRISPR-Cas9 ベクター

使用目的

  • 特定領域への遺伝子挿入
  • 特定部位における遺伝子発現のノックアウト
  • E.coli 、酵母、および哺乳類細胞のゲノム編集操作

CRISPR-Cas9 ベクターの特長

  • NickaseNinja™ の利用
    単一ベクターに2つのgRNAがタンデムで組込まれ、トランスフェクション効率が増大
  • プロモーターを選択可能:CMV / CBh / CAG
  • 2本鎖または1本鎖切断

Cas9 (S. pyogenes) は2本鎖切断を行います。一方、Cas9Nニッカーゼ変異体は1本鎖切断を行います(特異性をより向上させるためには、2つのタンデムgRNAをもつNickase Ninja™ ベクターを利用*1)。

Cas9 ヌクレアーゼは20塩基のガイド配列により誘導され、ほとんど全てのゲノム座位を切断可能です。これにより生じた染色体の破損は、通常、非相同末端結合(NHEJ)により修復されるため、標的座位にわずかな欠損や挿入が生じます。一方、相同ドナーDNAをCas9 とトランスフェクションした場合、相同性配向型のDNA修復システムが刺激され標的配列を期待する変異配列と置換できます。

Cas9 には、DNAの非相補鎖を切断するRuvC様ヌクレアーゼドメインと相補鎖HNHヌクレアーゼドメインという2つの触媒領域があります。ATUM社のCas9N またはニッカーゼは、Cas9 ヌクレアーゼのRuvC 様ヌクレアーゼドメインのD10A点変異体です。ガイドRNAは、ワトソン・クリック塩基対によりCas9 をゲノム標的に導くため、いかなるゲノム座位をも簡単に標的できます。

プロモータに関して特にご希望がない場合、またはATUM社で検証済みの細胞(HeLa, HEK293, CHO および神経細胞)以外の細胞をご利用の場合、3種を全てお試し頂くことをお奨めします。

CRISPR-Cas9 参考文献

・オフターゲット効果低減かつ挿入欠損効果増大に向けたCas9 ニッカーゼ戦略に関する報告
Science 2013. 339(6121):819. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR-Cas Systems.
・ゲノム編集用CRISPR-Cas9 システムに関する報告
Science 2013. 339(6121):823. RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9.

All-in-One NickaseNinja™

NickaseNinja™ ベクターの特長

  • 高精度かつオフターゲット効果を低減
  • 簡便:単一ベクターの形質転換
  • ニッカーゼベクターへのタンデムgRNAクローニング
  • 2A-結合型レポーターより選択
    DasherGFP、PaprikaRFP、レポータなし
  • 特許出願中

タンデムで2つのgRNAを搭載した単一ベクターによりトランスフェクション効率が増大!

ATUM社では、単一gRNA をE.coli 、酵母、および哺乳類細胞へElectra™ クローニング*2 できるカタログ商品のニッカーゼベクターと、タンデムで2つのgRNAを搭載した単一ベクターをデザイン、合成、プラスミド構築を一貫してカスタムプラスミド構築サービスとしてご提供するNickaseNinja™ All-in-Oneベクターの2種をご用意しています。
カタログ商品のニッカーゼベクターは、クローン作製にそのままご利用頂けます。Cas9 ヌクレアーゼは20塩基のガイド配列により誘導され、ほとんど全てのゲノム座位を切断可能です。これにより生じた染色体の破損は、通常、非相同末端結合(NHEJ)により修復されるため、標的座位にわずかな欠損や挿入が生じます。一方、相同ドナーDNAをCas9 とトランスフェクションした場合、相同性配向型のDNA修復システムが刺激され標的配列を期待する変異配列と置換できます。
カスタムプラスミド構築サービスとしてご提供するNickaseNinja™ All-in-Oneベクターは、2つのU6プロモーターを利用して単一ニッカーゼベクターから2種類のgRNAを同時発現でき、同時導入の必要性を省いたDNA社独自のシステムです。NickaseNinja™ ベクターには可視化用に蛍光レポータータンパク質が搭載されています。2種のgRNA搭載型NickaseNinja™ ベクターをご用意しており、ご希望の2つのgRNAを発現するプラスミドをDNA社にて構築致します。NickaseNinja™ All-in-Oneベクターのカタログ販売は行っておりません。

【ATUM社 カスタムサービスお問い合わせ先】
TEL:03-5632-9615 FAX:03-5632-9614
E-mail:Atum@cosmobio.co.jp

*2 Electra Vactor System™

Electra Vector System™ は、DNA社独自のIPフリーカセットクローニングシステムです。細菌、哺乳動物、酵母用の発現ベクターへの簡便かつ傷跡の残らないクローニングをわずか5分で実現します。詳細は「ATUM社 Electra Vector System™」のページをご参照ください。

ベクターマップ
図2. ベクターマップ
Cas9 ニッカーゼ挿入欠損頻度
図3. Cas9 ニッカーゼ挿入欠損頻度
ATUM社 All-in-One NickaseNinja™ ベクター(タンデムqRNAと2つのU6 プロモータを利用)、DNA社保有の2種のベクターを利用した場合および論文報告データとの比較結果。

CRISPR gRNA Design Tool

WEB上で使用できる無料のgRNAデザインツール!

ATUM社のCRISPR gRNA Design Tool は、ご希望の標的を効率よく変異しつつ、オフターゲット効果を低減できるgRNA 配列デザインが可能です。
ATUM社のWEBページより無料でご利用いただくことができ、デモンストレーションの動画もご用意しています。

ご希望の遺伝子または配列をご入力頂くと、デザインツールによりご入力配列内におけるCas9 標的部位を全て同定します。
予想される特異性などを基準にした各標的部位に対する順位リストなどが結果として出力されます。本プログラムで使用するアルゴリズムは、NGGとNAGのスペーサー前隣接モチーフ(PAM)の前方に位置する12塩基シード配列の出現率を考慮します。

DNA社 gRNAデザインツールの実績

  • 野生型またはニッカーゼCas9ベクター用にgRNAデザイン
  • NickaseNinja™ 用2つのタンデムgRNAデザインが簡便化
  • 遺伝子名、座位、または特定標的配列に対するデザインが迅速
  • ゲノム上の類似配列を避けたオフターゲット効果抑制
  • お客様が選択したgRNA配列をElectra™ CRISPRベクターへ組込むサービスもご提供、トランスフェクション可能な状態で納品します
DNA 社 CRISPR gRNA デザインツールのスクリーンショット
図4. ATUM社 CRISPR gRNA デザインツールのスクリーンショット
本デザインツールでは、標的への特異性をもとにgRNAの順位に従って表示し、スプライスバリアントや重複遺伝子に対する各gRNAの位置を表示します。文献報告では複数のgRNAを試して効率のよいものを探すことが通例です。

ATUM社 CRISPR-Cas9 Genome Engineering の検証

ATUM社のCRISPRベクターの検証にはHEK293細胞とEMX-1 遺伝子を利用しました。Electra™ システムを用いてgRNA 配列をpD13xx ベクターにクローンし、HEK293細胞にトランスフェクションしました。トランスフェクション後、ゲノムDNAを抽出し該当座位の配列決定を行いました。DNA社のベクターは、プロモーター配列により異なった挿入欠失(indel)頻度を示し、また同一座位を標的とした既報に匹敵する挿入欠失頻度を示しました。

・ 既報データ引用文献
Cell 2013. 155(2):479. Double nicking by RNA-guided CRISPR-Cas9 for enhanced genome editing specificity. Ran et al.
Science 2014. 343(6166):80. Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system. Wang et al.

インデル頻度はプロモータ強度を反映
図5. インデル頻度はプロモータ強度を反映
gRNA 配列をpD1301、pD1311 およびpD1321 にElectra™ クローニングした。HEK293 細胞に0.5μg のプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェク ションから72時間後、ゲノムDNA を抽出して配列決定した。ATUM社ベクターは、 使用したプロモータ配列によって異なるインデル頻度を示した。
pD1301 を用いたEMX-1 標的時の挿入欠失頻度
図6. pD1301 を用いたEMX-1 標的時の挿入欠失頻度
gRNA 配列をpD1301 にElectra™ クローニングした。HEK293 細胞に0.5μg のプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションから72 時間後、ゲノムDNAを抽出してEMX-1 遺伝子座の配列決定を行った。DNA 社ベクターは、同一座位を標的した既報に比べ全般的に高い挿入欠失頻度を示した。
NickaseNinja™ の検証
Cas9 ニッカーゼ挿入欠失頻度
図7. Cas9 ニッカーゼ挿入欠失頻度
ATUM社 All-in-One NickaseNinja™ ベクター(2 つのU6 プロモータによるタンデムgRNA を利用)、ATUM社 従来型2 ベクターシステムおよび既報データの比較結果。

 

クローニング情報

gRNAのPCR

ATUM社のpDAUGHTER-CRISPRベクターに直接クローニングできるよう、Electra™ サイトを含む下記配列をプライマー末端に付加することを推奨しています。

Forward primer:
5′-TACACGTACTTAGTCGCTGAAGCTCTTCTCCG....(gRNA)....-3′
Reverse primer:
5′-AGGTACGAACTCGATTGACGGCTCTTCTAAC....(gRNA Reverse Complement)....-3

プライマーを直接アニーリングする方法と、推奨末端をもち,かつ15-20bp のオーバーラップをもつプライマーをデザインして“ アニーリングと伸長” を行う方法があります。PCRは10サイクル行うことを推奨しています。下記のElectra™ 反応には1μl のPCR反応溶液をお使いください。
DAUGHTERベクターは、ボトムストランドに5’-CGG-3′、トップストランドに5’GTT-3´ のオーバーハングをもつ開環ベクターとしてご提供します(図7)。Electra™ 試薬ミックス存在下で、対象とするgRNA(またはPCR産物)と開環状pDAUGHTERCRISPRベクターと混合し、室温(25℃)で5〜20分放置します。

* Electra™ クローニングではII 型酵素SapI を使用するため、ご利用になるgRNAにSapI 制限酵素認識部位が存在しないことをご確認ください。

DAUGHTER ベクタークローニングサイト
図8. DAUGHTER ベクタークローニングサイト
ベクターマップ
図9. ベクターマップ

クローニング操作手順

  1. 右表に示した構成成分を1つの1.5mL チューブに混合する。
    * Daughter ベクターは、ATUM社より開環状で提供されます。
  2. 5〜20分間室温放置
  3. 2μL の反応溶液をコンピテントセルに形質転換
  4. 適切な抗生物質を含むLBプレートに播種
  5. 37℃で一晩培養。形質転換体を選択する。
構成成分 容量(μl)
MOTHER DNA/Positive Control* (20ng) 1
DAUGHTER Vector (20ng) 1
Electra™ Buffer Mix* (1X) 2
Electra™ Enzyme Mix* (1X) 1
Sterile ddH2O 15
全容量 20

Electra™ Cloning Reagents Kit

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
ElectraTM Cloning Reagents Kit詳細データ DNA EKT-03 50 RXN
¥53,000

CRISPR-Cas9 Genome Engineering 商品リスト

Cas9 Electra™ Daughters

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
CMV-Cas9 Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1301 10 RXN
¥53,000
CBh-Cas9 Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1311 10 RXN
¥53,000
CMV-Cas9-2A-GFP Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1301-AD 10 RXN
¥53,000
CBh-Cas9-2a-GFP Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1311-AD 10 RXN
¥53,000
CAG-Cas9-2A-GFP Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1321-AD 10 RXN
¥53,000
CMV-Cas9-2A-RFP Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1301-AP 10 RXN
¥53,000
CBh-Cas9-2A-RFP Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1311-AP 10 RXN
¥53,000
CAG-Cas9-2a-RFP Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1321-AP 10 RXN
¥53,000
CAG-Cas9-2A-Puro Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1321-APURO 10 RXN
¥53,000

Cas9 Nickase Electra Daughters

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
CMV-Cas9N Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1401 10 RXN
¥53,000
CBh-Cas9N Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1411 10 RXN
¥53,000
CMV-Cas9N-2A-GFP Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1401-AD 10 RXN
¥53,000
CBh-Cas9N-2A-GFP Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1411-AD 10 RXN
¥53,000
CAG-Cas9N-2A-GFP Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1421-AD 10 RXN
¥53,000
CMV-Cas9N-2A-RFP Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1401-AP 10 RXN
¥53,000
CBh-Cas9N-2A-RFP Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1411-AP 10 RXN
¥53,000
CAG-Cas9N-2A-RFP Cas9-ElecD詳細データ DNA PD1421-AP 10 RXN
¥53,000

All-in-One NickaseNinja™ カスタムプラスミド構築サービス

*1: 2つのgRNAをもつNickaseNinja™ ベクターは、ATUM社のカスタムプラスミド構築サービスとしてご提供しています。本サービスでは、ATUM社ニッカーゼベクターに対するデザイン、合成、プラスミド構築を一貫して承っておりますので、カタログ商品としてはご提供していません。NickaseNinja™ All-in-One ベクターよりお客様ご希望の二重gRNAを発現できます。

【ATUM 社 カスタムサービスお問い合わせ先】
TEL:03-5632-9615 FAX:03-5632-9614
E-mail:Atum@cosmobio.co.jp

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

お問い合わせ

「ATUM社 CRISPR-Cas9 Genome Engineering/All-in-One NickaseNinja™ vector」は、下記のカテゴリーに属しています。

商品検索

商品情報

サポート情報

メーカー・代理店一覧

企業情報

関連サイト


© COSMO BIO