各種ヒストンとの相互作用をハイスループットスクリーニング EpiTitan™ ヒストンペプチドアレイ

ヒストンペプチドに対する、エフェクタータンパク質、抗体、酵素の相互作用を、ハイスループットスクリーニングするために開発されたアレイです。ストレプトアビジンコートされたスライドガラスに、ビオチン化され、修飾されたヒストンペプチドの組み合わせが固定されています。4つのコアヒストン（H2A、H2B、H3、H4）、および、いくつかのヒストン変異体に対して、95種類以上の修飾を網羅しています。各アレイには、265種類以上のヒストンペプチドがそれぞれ12回スポットされ、抗体・タンパク質の結合、酵素活性を正確に評価できます。アレイにプリンティングされているペプチドは、広範囲にバリデートされ、精製された、高品質のものを用いています。

図1　EpiTitan™ ヒストンペプチドアレイのワークフロー
エフェクタータンパク質とペプチドとの相互作用を検出するために、タンパク質（またはタンパク質のエピトープタグ）に対する一次抗体と、蛍光（またはECL検出のためのHRP）標識二次抗体が必要になります（免疫蛍光顕微鏡での検出手順と同様）。ヒストン抗体特異性の解析には、ヒストン修飾に対する一次抗体と、一次抗体を認識する蛍光（またはHRP）標識二次抗体が必要です。

• 修飾ヒストン抗体の選択性および特異性の調査
• ヒストン結合タンパク質の特異性解析
• ヒストン修飾酵素の基質の同定

• 偽陰性および偽陽性を大幅に低減、実験にかかる時間とコストを削減
• マルチウェルガスケット（品番： 11-3001）の使用により、1つのアレイで2種類の実験が可能
• HPLCによる品質管理で、アレイ解析から以降の実験までペプチドの品質を保証
• 結果の再現性が高く、研究室間での検証が可能
• 高品質のヒストンペプチドアレイにより、誤差を低減
• アレイスポットの前に合成・検証が行われ、20残基に限定されない EpiTitan ペプチド
• 1つのペプチドに最大6種類の修飾が可能（他社製品は最大4種類）

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図2　アレイデザイン
各アレイは、ストレプトアビジンコートスライドガラス上に固定された265種類以上のビオチン化ヒストンペプチド（長さは20アミノ酸以上）を含みます。ペプチドは、2つの同じサブアレイ（AとB）にスポットされています。それぞれのサブアレイに、各ペプチドが3個ずつのグループで2回スポットされており、各ペプチドのスポット数は合計12／アレイとなります（赤丸で示します）。

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図3　ECL／蛍光によるアレイデータ
ヒストン H3 K4Me3 抗体（品番： 13-0004）の結合特異性をヒストンペプチドアレイで検出。
左： 抗体結合の蛍光スキャン。スポットトレーサー（特許取得済み）を緑色、H3K4Me3 結合を赤色で示す。
右： K4Me3 抗体結合をECLで検出。X線フィルムに30秒間感光させて可視化。

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図4　ヒストンメチルトランスフェラーゼアッセイ
ヒストン Lys9 メチルトランスフェラーゼ（リコンビナント）を使用して、EpiTitan™ ヒストンペプチドアレイ上のペプチドをメチル化した。
左（-KMT）： コントロール（酵素なし）
右（+KMT）： 酵素をアレイに添加
H3K9me2 認識抗体を使用して、メチル化を検出した。白枠は、酵素を添加する前に、抗体によって検出された H3K9 メチル化ペプチドを示す。新しく検出されたスポットは、H3K9me2 の新しいサイトを示す。これらの結果から、ヒストン修飾酵素の基質特異性の検出に、EpiTitan™ ヒストンペプチドアレイが有用であることが示される。

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