エクソソーム/細胞外小胞 染色試薬│Biotium社

• 準備：室温で付属のbuffer※で1×染色液を使用日当日に調整。
• 染色：精製EV 50 µLに450 μLの1×溶液を加えて混和し、室温 遮光で30分静置。
• 測定：洗浄不要でフローサイトメトリーで測定。
  ※AnnexinがBinding Buffer（Ca??入り）で他はPBS

図1. SEC 精製済のMCF-7由来EV を、ExoBrite™ 515/540 True（左）、PKH67（中央）、Neuro-DiO（右）で染色しフローサイトメトリーで検出。ExoBrite™ 515/540 True EV Membrane Stainは背景粒子とEVを明確に区別でき、高い検出性能を示した。

• 前処理：メーカー推奨手順に従って、磁性キャプチャービーズに結合したEVを調製。
  使用日当日に付属のbuffer※で10X染色液を調整。
• 染色：上清を除いたビーズを10×染色液 50 µLで懸濁し、室温 遮光で30分静置。チューブを磁石の上に1分間置き、上清を除去して廃棄。
• 洗浄(任意）：付属のbuffer※ 100 µLで懸濁し1分静置。磁石上に1分置き上清を除去。
• 測定：付属のbuffer※ 500 µLで懸濁しフローサイトメトリーで測定。
  ※AnnexinがBinding Buffer（Ca??入り）で他はPBS

図2. CD63ビーズ結合EVのフローサイトメトリー解析。ExoBrite™ 490/515 CTBとCD81-CF®568で共染色し、FITCおよびPEチャネルで検出。ExoBrite™染色EVは、エクソソームマーカーであるCD81と98%以上の共陽性率を示した。

• 前処理:“精製済EVの染色”の手順後、5~10mLのろ過水で希釈。1:50~1:500の範囲で希釈率を検証（1:100から開始を推奨）。
• 解析：ZetaView® x30で以下条件にて測定。

図3. SEC精製EVをExoBrite™ True、Neuro-DiO、PKH67、DiIで染色し、ZetaView粒子解析装置で測定。ExoBrite™ Trueは95%以上のEVを標識し、最も高いカバレッジを示した。

基本的な手順は“精製済EVの染色”と同じです。

• 染色：染色時に抗体もメーカー推奨濃度で添加し、室温 遮光で30分静置。
• 測定：洗浄不要でフローサイトメトリーで測定。
  抗体染色を先に行い、その後ExoBrite™染色を行うことも可能です。

図4. SEC精製EVをCD9-CF®488A（1 µg/mL）で染色後にExoBrite™ 560/585 CTBで染色。相互ゲーティングの結果、ExoBrite ™ CTB陽性粒子の約95%がCD9陽性（上）であり、またCD9陽性粒子の約95%がExoBrite ™ CTB陽性を示し（下）、ExoBrite ™ CTBが抗体共染色に適合することを確認した。

特徴

• 精製EVおよびビーズ結合EVに対応
• 明るい蛍光で高感度に検出
• 低バックグラウンドで明瞭なシグナル

図4. SEC精製HEK293由来EVをExoBrite™抗体（CD9/CD63/CD81）で染色し、フローサイトメトリーにより検出。対照のPBSではごくわずかな凝集しか見られず、低バックグラウンドで明瞭なシグナルが得られた。

• EV抽出物中のCD9, CD63, CD81をWBで検出するために開発
• EV抽出物で検証済み
• 高輝度シグナルかつ低バックグラウンド
• 近赤外領域の2色とHRP標識で提供
• 単離EVの純度評価用のネガティブコントロール抗体（小胞体タンパク質Calnexinを標識）を用意

図5. MCF-7細胞ライセート（cell 10, cell 1│10 µg, 1µg）および培養上清からSECで単離したEV（exo 1│1 µg）を用いたWestern blot。サンプルをSDS-PAGE後PVDF膜に転写し、TrueBlack® Western Blocking Bufferでブロッキング。ExoBrite™ Western Antibodies（CD9/CD63/CD81, CANX）で染色し、LI-COR Odyssey®システムで検出。

• 超解像顕微鏡（dSTORM）に最適化されたCF®色素を採用
• EVマーカー抗体（CD9/CD63/CD81）とCTB膜染色試薬をラインナップ
• 高いシグナル／ノイズ比で単一EVレベルの解析が可能
• 抗体染色と膜染色を併用した局在解析にも対応

図6. ヒト大腸癌細胞株由来のEVをdSTORMイメージングで解析。EVは抗CD9/CD63/CD81抗体カクテル（マゼンタ）とExoBrite™ （シアン）で染色。サンプルはONI社EV Profiler Kitで調製し、Nanoimager S Mark IIで取得。解析はクラウドプラットフォームCODI（ベータ版）を使用。スケールバー：500 nm（左）、50 nm（右）。