磁性ビーズベースの高感度マルチプレックスアッセイ EYRAplex

Mabtech社が誇る信頼性の高いモノクローナル抗体ペアを磁気ビーズと組み合わせたEYRAplexアッセイは、毎回安定した結果を提供するよう設計されています。6プレックスに特化したパネルから30プレックスの広範囲なフォーマットまで、EYRAplexは「より少ない試料でより多くを解析」でき、時間・リソース・サンプル量を節約します。
Mabtech社のELISpot、FluoroSpot、ELISAアッセイで使用されている高い特異性を持つ同一のモノクローナル抗体ペアが、EYRAplexでは新しいマルチプレックス形式でご利用いただけるようになりました。
さらに、リコンビナント検出抗体と新規アッセイバッファーの採用により、異好抗体干渉（非特異的反応）の問題が解消されました。なおEYRAplexキットは、Mabtech EYRA™ または一般的なフローサイトメーターのどちらでもご使用いただけます。

目次

• ビーズIDとは
• 特長
• Step-by-stepでみる測定のながれ

磁気ビーズベースのマルチプレックス測定の中心となるのが「ビーズID（Bead ID）」です。EYRAplexアッセイにおいて、各磁気ビーズはそれぞれ異なる比率の蛍光色素で染め分けられており、固有の「ビーズID」として識別されます。
各ビーズタイプには特定のキャプチャー抗体が固定化されており、このビーズIDが個々の抗原（測定対象物質）と直接対応します。この洗練された設計により、真のマルチプレックス解析が可能となり、単一のウェル内で、複数の抗原を同時に測定できます。またすべての測定は共通のフィコエリスリン（PE）蛍光検出シグナルを用いて行われます。RAWsphereアルゴリズムを搭載したMabtech EYRA™は、ビーズIDの識別とPEシグナルの定量化を行い、個々の蛍光イベントを対応する抗原と容易に結びつけます。

• 測定可能サンプル：血漿（ヘパリンまたはEDTA）、血清、細胞上清
• 高感度：Mabtech社独自のモノクローナル抗体ペアを採用したEYRAplexは、他社のビーズベースアッセイと比較して優れた検出感度を発揮します。各種抗原において、競合品よりも多くのサンプルを定量可能との結果が得られています。
  

  

• 異好抗体干渉の影響を低減：異好抗体（heterophilic antibodies）は、ヒト抗マウス抗体（HAMA：Human Anti-Mouse Antibody）を含み、アッセイ中で非特異的に反応してしまうことがよくあります。これにより、キャプチャー抗体と検出抗体を架橋して偽陽性を引き起こしたり、一方の抗体の結合を阻害して偽陰性をもたらしたりします。この干渉は、自己免疫疾患や感染症など、患者サンプルでは特に顕著になります。EYRAplexアッセイでは、この問題を解決するために リコンビナント検出モノクローナル抗体（recombinant detection mAb）と特殊なアッセイバッファーを採用しています。これにより干渉をブロックし、可能な限り正確なデータを得ることができます。
  

  

  
  ブランクサンプルにリウマトイド因子（RF）を添加した結果。これにより、競合製品1における偽陽性シグナルはEYRAplexと比較して有意に増加した。

• 一般的なフローサイトメーターと互換性あり：EYRAplexアッセイはすべて、ほとんどのフローサイトメーターと完全に互換性があります。詳細な要件はデータシートに記載されています。

1. 材料の準備
   アッセイを始める前に、すべての試薬と機器が揃っていることを確認してください。 必ず使用するキットのデータシートを参照し、アッセイ固有の要件を確認しましょう。

   試薬および消耗品

   

   • EYRAplexキット
     • キャプチャービーズミックス*
     • 検出用モノクローナル抗体ミックス
     • スタンダードミックス
     • ストレプトアビジン-PE*
     • ストレプトアビジン-PE希釈液
     • アッセイ希釈液：EYRAplex**
     • 洗浄バッファー濃縮液
     • 96ウェル ブラックプレート（蓋および接着シール付き）
      
   • 高精度ピペット及びチップ
   • 0.2 µmフィルター（直径25 mm推奨）およびシリンジ
   • 蒸留水または脱イオン水

   試薬および消耗品

   • オービタルシェーカー（推奨：3 mm軌道、800 rpm）
   • 磁気ビーズ対応 96ウェルプレート洗浄装置（自動または手動）
   • Mabtech EYRA™または一般的なフローサイトメーター
   
   *すべての蛍光試薬およびプレートは、インキュベーション中は遮光してください。
   **アッセイ希釈液は、インキュベーションの合間や未使用時には冷蔵保存してください。

   洗浄について

   ほとんどのイムノアッセイと同様に、洗浄ステップは成功のために極めて重要です。自動・手動を問わず、お客様の洗浄プロトコルに柔軟に対応できるよう、各キットには十分な量の濃縮洗浄バッファーを同封しています。各社の磁気プレート洗浄装置の使用プロトコルについては、こちらをご覧ください。

2. 各種試薬の溶解と調製

   スタンダード

   凍結乾燥されたスタンダードに、アッセイ希釈液を0.25 mL加えます。溶解するまで5分間静置し、その後よく混合してから、データシートに記載されている通りに希釈系列を作成してください。スタンダードは、アッセイを行うたびに新しく溶解・調製する必要があります。
   

   

   洗浄バッファー

   　

   20倍に希釈してください。（例：バッファー50 mLに対し、水950 mLを加える）

   検出モノクローナル抗体ミックス

   　

   データシートの指示に従ってアッセイ希釈液で希釈し、15分以内に使用してください。

   ストレプトアビジン-PE

   　

   使用直前にストレプトアビジン-PE希釈液で100倍に希釈し、遮光してください。

   サンプル

   　

   溶解したサンプルは遠心分離し、必要に応じて希釈してください。

   • 血漿／血清: アッセイ希釈液で少なくとも4倍以上に希釈することを推奨します。
   • 細胞培養上清: 希釈せずにそのまま、あるいは測定対象物質の濃度が定量上限（ULOQ）を超えると予想される場合はアッセイ希釈液で希釈して測定してください。

3. キャプチャービーズの添加

   

   各EYRAplexキットに同封されている「キャプチャービーズミックス」には、モノクローナル抗体が結合したビーズパネルが、すぐに使用できる濃度でプレミックスされています。ビーズを取り扱う際は、頻繁にボルテックス（撹拌）を行い、遮光することが極めて重要です。

   • 「キャプチャービーズミックス」を少なくとも30秒間ボルテックスし、直ちに各ウェルに50 µLずつ添加します。 ビーズはすぐに沈降するため、分注中は30秒ごと、または12ウェルごとに短くボルテックスすることを推奨します。
   • 前述の通り、希釈した洗浄バッファーを1ウェルあたり200 µLずつ用いて、4回洗浄します。 洗浄ステップの後、ビーズはほとんど乾燥した状態になります。
    
4. サンプルとスタンダードの添加

   

   スタンダードの調製およびサンプルの希釈は、アッセイを実施する当日に行ってください。 各ウェルに添加するスタンダードまたはサンプルの最終量は50 µLとなるため、プレートレイアウトおよび反復測定の数に応じて、必要量を計算して調製します。少なくとも2重測定を推奨します。

   • 希釈したサンプルまたはスタンダードを 各ウェルに50 µL添加します。
   • 粘着フィルムと黒色の蓋でプレートを覆います。
   • 室温で2時間、または 4〜8 °Cで一晩、オービタルシェーカー（800 rpm）上でインキュベートします。
   • 各ウェルを 200 µLの希釈済み洗浄バッファーで4回洗浄します。
    
5. 検出用モノクローナル抗体ミックスの添加

   

   サンプル／スタンダードのインキュベーション後、プレートを洗浄する直前に、検出用モノクローナル抗体ミックスを調製します。アッセイ希釈液で希釈し、0.2 ?mフィルターでろ過してください。
   各ウェルに添加する最終量は50 µL となるため、プレートレイアウトと反復測定数に応じて必要量を計算します。

   • 希釈した検出抗体混合液を 各ウェルに50 µL 添加します。
   • 粘着フィルムと黒色の蓋でプレートを覆い、室温で1時間、800 rpm のオービタルシェーカー上でインキュベートします。
   • 各ウェルを 200 µLの希釈済み洗浄バッファーで4回洗浄します。
   • 各ウェルを 200 µLの希釈済み洗浄バッファーで4回洗浄します。
    
6. ストレプトアビジン-PEの添加

   

   ストレプトアビジン-PE は、ストレプトアビジン-PE希釈液で希釈して使用します。この溶液も、前の洗浄ステップの直前に調製してください。各ウェルに添加する最終量は50 µLとなるため、プレートレイアウトおよび反復測定数に合わせて必要量を計算します。

   • 希釈したストレプトアビジン-PEを各ウェルに50 µL添加します。
   • 粘着フィルムと黒色の蓋でプレートを覆い、室温で30分、800 rpm のオービタルシェーカー上でインキュベートします。
   • 各ウェルを 200 µLの希釈済み洗浄バッファーで4回洗浄します。
    
7. 解析準備（Mabtech EYRA™を用いる場合）

   

   Mabtech EYRA™は、各ウェルに50 µLのアッセイ希釈液が入ったEYRAplexプレートを解析できるよう最適化されています。

   • 各ウェルにAssay diluentを50 µL添加します。
   • 粘着フィルムと黒色の蓋でプレートを覆いMabtech EYRA?でデータを取得する前に、ビーズを20分間静置して沈降させます。
   • プレートはすぐに測定しても構いませんが、翌日に測定する場合は冷蔵庫で一晩保存しておくこともできます。
     o 翌日に測定する場合は、測定前にプレートをオービタルシェーカーで5分間攪拌し、その後20分間静置してビーズを沈降させてください。
    
8. 解析準備（フローサイトメーターを用いる場合）

   前述の通り、EYRAplexアッセイは、Mabtech EYRA™だけでなく、一般的なフローサイトメトリー解析にも対応しています。
   

   フローサイトメーターの要件

   • 赤色レーザー（635?640 nm）
     検出波長：660 nm（APCまたは同等の蛍光色素用）、780 nm（APC-Cy7 または同等の蛍光色素用）
   • 青色（488 nm）／緑色（532 nm）／黄緑色（561 nm）レーザー
     検出波長：575 nm（PE または同等の蛍光色素用）
   
   各ウェルにPBSを100 µL添加し、フローサイトメーターの推奨イベントレート（1秒あたりのイベント数）に従って、低流速でデータを取得してください。
   
   
   フローサイトメーターおよびMabtech EYRA™で取得したデータを用いて作成した、EYRAplexスタンダードカーブの比較

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