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研究用

従来法の単一波長蛍光カルシウム指示薬蛍光単一波長カルシウム指示薬

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カルシウムは様々な細胞での万能なセカンドメッセンジャーです。無数の機能が Ca2+ により制御されているため、カルシウム指示薬を用いたカルシウム測定は重要な生化学調査の1つになっています。1920年代から Ca2+ の測定が試みられ多様な指示薬が開発されてきました。

蛍光指示薬を用いることで、細胞内の遊離Ca2+濃度の変化を各種機器 (蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光分光法及び蛍光マイクロプレートリーダー) から確認することができます。これら蛍光指示薬のほとんどが、カルシウムに応答するPET機構 (光誘起電子移動) を組み込んだBAPTAキレーターの誘導体です。蛍光指示薬を選択する際は、ご自身の実験に適したスペクトル特性、測定モード、透過性 (AMフォーム:生細胞中のアッセイに適した細胞透過性タイプ、塩フォーム:生細胞や組織へのマイクロインジェクションに適したタイプ)、 解離定数 (Kd) を選択ください。

  • スペクトル特性:UV励起には、Indo-1とFura-2が広範に使用されています。Fura-8™は新しく開発された励起を比率化できるカルシウム色素です。そのAM体はFura-2 AMより優れており、細胞内での高いシグナル/バックグラウンド比率を示します。Fluo-8®, Cal-520®、Calbryte™ 520 は、488nm励起が好まれることに対し、Cal-590™、Calbryte™ 590、Cal-630™、Calbryte™ 630、Rhod-2、および Rhod-4™は赤色蛍光に使われます。
  • 測定モード:イオン結合によりスペクトルシフトを示すイオン指示薬は、Ca2+濃度の比率計測に使用でき、不均一な色素のローディング、細胞の厚さ、光退色効果、及び色素漏出には基本的に依存しません。励起と蛍光波長の嗜好性は、使用機器のタイプやサンプルの自己蛍光、および実験系に他の蛍光や光で活性化されるプローブが存在するかどうかに依ります。 Indo-1、Fura-2 、およびAAT Bioquest社の開発したFura-8™は主に比率計測用に使われ、Fluo-3、Fluo-4、Fluo-8®、Cal-520®、Calbryte™ 520、Cal-590™、Calbryte™ 590、Cal-630™、Calbryte™ 630、Rhod-2、およびRhod-4™は主に単一波長測定で使われます。
  • Ca2+指示薬の透過性 (塩またはAMエステル):塩形態のものは通常、微量注入、微粒子銃、またはエレクトロポレーションで細胞に導入されるか、細胞外アッセイに使用されます。これに対し、細胞透過性アセトキシメチル (AM) エステルは細胞内に受動的に導入することができ、そこで細胞内エステラーゼにより細胞不透過性産物へと切断されます。
  • 解離定数 (Kd): 希望する指示薬は対象とする Ca2+濃度領域に対して適切な Kd値をもつ必要があります。Ca2+指示薬のKd値は、pH、温度、イオン強度、年度、タンパク質結合、Mg2+ や他のイオンの存在といた数々の因子に依存します。その結果、細胞内指示薬の Kd値は対応する無細胞溶液中で測定した値に比べ通常著しく高くなります。可視光励起カルシウム指示薬のうち、Fluo-8®、Fluo-4、Fluo-3、Rhod-2、および Rhod-4™ が最も一般的に使用されています。Fluo-8® 指示薬はフローサイトメトリーと共焦点レーザー走査顕微鏡において幅広く使用されています。近年では Fluo-8® AM が GPCR標的のハイスループットスクリーニングにおいてよく使用されています。Fluo-8® は Ca2+ に結合し飽和Ca2+の存在下で〜0.15の量子収量を示しCa2+に対してKd が 390 nM を示さない限り、基本的に非蛍光です。Cal-520® はシグナル/バックグラウンド比率と細胞内保持力が非常に改善された頑強な緑色蛍光カルシウム指示薬です。Calbryte™ 520 は、シグナル/バックグラウンド比率と細胞内保持力が著しく改善され、さらに簡単な細胞色素導入特性をもつ、突出して優れた 488 nm で励起する緑色蛍光カルシウム指示薬です。

従来法の単一波長蛍光カルシウム指示薬

長波長 Rhod-4™ は、自己蛍光レベルの高い細胞や組織を用いる実験において緑色蛍光の Ca2+指示薬であるFluo-8®、Fluo-4、および Fluo-3 の代替品として優れています。Rhod-5N は、他の BAPTA を基にした指示薬 (Kd = 〜320 µM) のどれよりも Ca2+ に対してより低い結合親和性をもち、10 µM から 1 mM までの Ca2+測定に適しています。その元である Rhod-2 指示薬のように、Phod-5N は二価陽イオン非存在下では基本的に非蛍光性であり、Ca2+ への結合においてスペクタルシフトなしの強力な蛍光増強を示します。いずれの Fluo、Rhod 指示薬も細胞非透過性カリウム塩または細胞透過性AMエステルとしてご提供しています。

表.1 従来の単一波長蛍光カルシウム指示薬
品番 品名 Ex (nm) Em (nm) Kd
20500  Cal GreenTM 1, hexapotassium salt 506 531 190 nM
20501  Cal GreenTM 1, AM [Equivalent to Calcium Green-1, AM] 506 531 190 nM
21011  Fluo-3, AM *UltraPure grade* 506 526 390 nM
21018  Fluo-3, pentaammonium salt 506 526 390 nM
21017  Fluo-3, pentapotassium salt 506 526 390 nM
21016  Fluo-3, pentasodium salt 506 526 390 nM
20507  OG488 BAPTA-1, AM [equivalent to Oregon Green(R) 488 BAPTA-1, AM] *Cell permeant* 494 523 170 nM
20506  OG488 BAPTA-1, hexapotassium salt [equivalent to Oregon Green(R) 488 BAPTA-1, hexapotassium salt] *Cell impermeant* 494 523 170 nM
21064  Rhod-2, AM *UltraPure Grade* 549 578 570 nM
21067  Rhod-2, tripotassium salt 549 578 570 nM
21068  Rhod-2, trisodium salt 549 578 570 nM
21070  Rhod-5N, AM 551 577 0.3 mM
21072  Rhod-5N, tripotassium salt 551 577 0.3 mM
品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Cal GreenTM 1, hexapotassium salt詳細データ ABD 20500 10*50 UG
¥30,000
Cal GreenTM 1, AM [Equivalent to Calcium Green-1, AM]詳細データ ABD 20501 10*50 UG
¥30,000
Fluo-3, AM詳細データ ABD 21011 1 MG
¥37,000
Fluo-3, pentaammonium salt詳細データ ABD 21018 1 MG
¥30,000
Fluo-3, pentapotassium salt詳細データ ABD 21017 1 MG
¥30,000
Fluo-3, pentasodium salt詳細データ ABD 21016 1 MG
¥30,000
OG488 BAPTA-1, AM [equivalent to Oregon Green(R) 488 BAPTA-1, AM] *Cell permeant*詳細データ ABD 20507 10*50 UG
¥41,000
OG488 BAPTA-1, hexapotassium salt [equivalent to Oregon Green(R) 488 BAPTA-1, hexapotassium salt] *Cell impermeant*詳細データ ABD 20506 500 UG
¥41,000
Rhod-2, AM *UltraPure Grade*詳細データ ABD 21064 20*50 UG
¥51,000
Rhod-2, tripotassium salt詳細データ ABD 21067 1 MG
¥41,000
Rhod-2, trisodium salt詳細データ ABD 21068 1 MG
¥41,000
Rhod-5N, AM詳細データ ABD 21070 1 MG
¥51,000
Rhod-5N, tripotassium salt詳細データ ABD 21072 1 MG
¥51,000

【関連商品】

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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