ioMicroglia ヒトiPS細胞由来ミクログリア（男性/女性）｜Bit Bio社

細胞播種後、短期間で分化・成熟させることが可能

ioMicrogliaは凍結保存された状態で提供され、推奨培地で培養すると急速に成熟するようにプログラムされています。これらの細胞の分化プロトコルは3段階のプロセスで構成されており、24時間の安定化期間を経て、9日間の成熟期間を継続し、その後に維持期間に入ります。

細胞の形態

重要な分岐形態は解凍後4日目以内に現れて、10日目まで続いた（100X）。

表現型マーカーの発現

培養10日目のioMicrogliaにおいて、DAPI染色と免疫蛍光染色を用いてMERGEを作成した。DAPIで細胞核を染色し、特異的な抗体を用いてP2RY12、IBA1、およびTREM2を染色した。

ioGlutamatergic neurons と ioMicroglia の共培養

培養10日目の ioGlutamatergic neurons に、培養１日目もしくは10日目の ioMicroglia を播種して共培養を確立した。共培養８日目に免疫蛍光染色を行ったところ、ミクログリアのマーカーであるIBA１と神経マーカーであるMAP２の発現が示された。

ロット間の高い一貫性

男性ドナー由来ioMicrogliaの異なる3ロットにおいて、細胞融解後1日目、10日目にバルクRNAシーケンス解析を実施した結果、各時点でロット間の高い一貫性が示された。

男性ドナー由来ioMicrogliaの異なる3ロットにおいて、1 µg/0.33 cm² pHrodo RED標識大腸菌で24時間処理し、大腸菌粒子を貪食した細胞の割合を調べた結果、高い一貫性が示された。

男性ドナー由来ioMicrogliaはC5αを介した走化性を示す

男性ドナー由来ioMicrogliaを1週間成熟させたのち、Incucyte Chemotaxis解析ソフトウェアモジュールを搭載したClearviewプレートを用いて走化性を評価した結果、走化性因子であるC5αを含むリザーバーへのioMicrogliaの遊走が認められた。
※このデータは、Medicines Discovery CatapultのEve CorrieとEmma V. Jonesによって作成された（Eve Corrie, Emma V. Jones, Medicines Discovery Catapult, Block 35, Mereside, Alderley Park, Macclesfield, SK10 4ZF. UK.）。

ioCellsとの共培養にも対応

ioGlutamatergic Neuronsと共培養

Incucyte^® Neuroburst Orange Lentivirus を発現する ioGlutamatergic Nuronsを、単独培養、または男性ドナー由来ioMicrogliaと共培養し、Incucyte^® Neuronal Activity Analysis ソフトウェアを使用してモニタリングおよび定量化した。
(A) ミクログリア添加後 15 日目に各培養条件で示された代表的なカルシウム痕跡。
(B) ミクログリア添加後 15 日目のネットワーク相関と平均バースト持続時間を示す棒グラフ
（データは平均±SEM、n = 3〜12の反復実験）。

細胞の形態

重要な分岐形態は解凍後4日目以内に現れて、10日目まで続いた（100X）。

表現型マーカーの発現

培養10日目のioMicrogliaにおいて、DAPI染色と免疫蛍光染色を用いてMERGEを作成した。DAPIで細胞核を染色し、特異的な抗体を用いてP2RY12、IBA1、およびTREM2を染色した。

ロット間の高い一貫性

女性ドナー由来ioMicrogliaの異なる3ロットにおいて、細胞融解後1日目、10日目にバルクRNAシーケンス解析を実施した結果、各時点でロット間の高い一貫性が示された。

貪食機能

培養開始から4、6、10日目に、女性ドナー由来ioMicrogliaをpHrodo RED標識大腸菌粒子と共に24時間インキュベートした。
（左）貪食細胞の割合、（右）貪食作用の程度を示す蛍光強度

培養開始10日目の女性ドナー由来ioMicrogliaを、500 nM AF488標識 Amyloidβ-42（AnaSpec）と共に 24時間インキュベートした。
（左）貪食細胞の割合、（右）貪食作用の程度を示す蛍光強度

ioCellsとの共培養にも対応

ioGlutamatergic Neuronsと共培養

共培養8日目の免疫蛍光染色では、ミクログリアマーカーIBA1（緑）と汎神経細胞マーカーMAP2（赤）の発現が確認された。

男性由来ドナーとの相違

女性ドナー由来 ioMicroglia は、男性ドナー由来 ioMicroglia とは異なるレベルの貪食作用を示す。

3つの独立したロットから採取した女性ドナー由来 ioMicroglia および単一ロットから採取した男性ドナー由来 ioMicroglia にpHrod™ RED で標識したザイモサン粒子を添加した。その後、24時間に渡ってサイトカラシンDを添加した条件と、添加していない条件を比較した。その結果、女性ドナー由来 ioMicroglia は、男性ドナー由来 ioMicroglia と比較して貪食の割合が高かった。

女性ドナー由来の ioMicroglia は、男性ドナー由来の ioMicroglia とは異なる炎症誘発性サイトカイン反応を示す。

３つの独立したロットから採取した女性ドナー由来 ioMicroglia および単一ロットから採取した男性ドナー由来 ioMicroglia を、LPS (100 ng/ml) および IFNɣ (20 ng/ml) で 24 時間刺激した。その結果、女性ドナー由来 ioMicroglia は、男性ドナー由来 ioMicroglia と比較して IL-8 および IL-1β サイトカインの分泌レベルが高く、 IL-12p70 サイトカインの分泌レベルが低かった。