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記事ID : 15720
研究用

免疫沈降抗体由来のバックグラウンドを大幅に低減Pure-IP™ ウェスタンブロット検出キット

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Pure-IP™ ウェスタンブロット検出キットは、免疫沈降後のウェスタンブロット解析でのバックグラウンドを大幅に低減します。本製品に含まれる独自のHRP標識コンジュゲートは、未変性抗体を優先的に検出するため、免疫沈降抗体由来の重鎖・軽鎖の干渉を抑えることができます。

キットには、イムノブロット20 回分(8 cm x 8 cm)の試薬(ブロッキング試薬/洗浄液/HRP標識コンジュゲート)が含まれます。

背景

IP-WBにおけるバックグラウンドについて

免疫沈降法(IP:immunoprecipitation)は、抗体固定化樹脂を用いて特定のタンパク質を単離・精製するための手法です。

一般的に、捕捉されたタンパク質は変性条件下でアガロースビーズから溶出されます(この時、IPで使用した抗体も溶液中に放出されます)。その後、多くの場合でIPに使用した抗体で目的タンパク質のウェスタンブロッティング解析を行いますが、その際、変性した抗体由来の重鎖と軽鎖が大規模なバックグラウンドとして検出されることが問題となります(図1 レーン1)。

Cell Biolabs社のPure-IP™ ウェスタンブロット検出キットには、未変性の抗体を優先的に検出するHRP標識コンジュゲートが含まれており、変性抗体の重鎖と軽鎖によるバックグラウンドを大幅に低減することができます。

特長

  • IP-WBにおいて、免疫沈降に用いた抗体の重鎖および軽鎖の検出を低減
  • ほとんどの種のIgG 一次抗体と使用可能
  • 化学発光/比色検出システム両方に適合

構成内容

  • 1000X HRP 標識コンジュゲート
  • 20X 洗浄バッファー
  • Pure-IP™ ブロッキング試薬

プロトコール

  1. 1X RIPAバッファーなどで細胞または組織ライセートを調製します。
  2. 目的タンパク質に対する抗体とプロテインAまたはプロテインGアガロースビーズで免疫沈降(IP)を行います。
  3. ポリアクリルアミドゲルにサンプルをロードし、電気泳動を行います。
  4. ニトロセルロース膜またはPVDF膜に転写します。
  5. 転写装置から膜を取り出し、10mLのPure-IP™ ブロッキング溶液内に浸漬し、1時間穏やかに振盪します。
  6. 10mLのPure-IP™ ブロッキング溶液で一次抗体を希釈します。
  7. 膜をブロッキング溶液から取り出し、一次抗体溶液を加えます。
  8. 穏やかに振盪しながら室温で1〜2時間(または4℃で一晩)インキュベートします。
  9. 1X洗浄バッファー10mlで10分間の洗浄を3回繰り返します。
  10. 10 mLの1XHRP標識コンジュゲート溶液を加え、膜を室温で60分間インキュベートします。
  11. 1X洗浄バッファー10mlで10分間の洗浄を4回繰り返します。
  12. 比色または化学発光ウエスタンブロット検出試薬で検出します。
  13. フィルムやCCDカメラに膜を露光します。

使用例

モノクローナル抗体と混合したHeLa細胞ライセートのアクチン検出
図1. モノクローナル抗体と混合したHeLa細胞ライセートのアクチン検出。
HeLa細胞ライセートは、RIPAバッファー(AKR-190)を用いて調製した。HeLa細胞ライセート20μgとモノクローナル抗体2μgの混合物を各レーンにロードした。

レーン1:HRP標識ヤギ抗マウス抗体
レーン2:本製品の1X HRP標識コンジュゲート

Pure-IP™ ウェスタンブロット検出キット

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Pure-IPTM Western Blot Detection Kit詳細データ CBL PRB-5002 20 BLOT
¥59,000
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