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記事ID : 14174
研究用

ミトコンドリア染色用 JC-1 試薬 5本入りJC-1 ミトコンドリアアッセイ ‐MarkerGene™‐

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MarkerGene™ JC1 ミトコンドリアアッセイキット には、生細胞内のミトコンドリアを染色するJC-1色素(ready to use)が5バイアル含まれます。染色するサンプルは、完全培地中で染色することができ、実験条件の変更を最小限に抑えることができます。また、5X Opti-Klear™ 生細胞イメージングバッファー(単品:M1898) を使用することで、大部分の培地で見られる蛍光バックグラウンドが低減されます。JC-1は、試験したほとんど全ての細胞種で有用な、生細胞中のミトコンドリアの健康状態を示す最も信頼できるマーカーの一つです。

背景

ミトコンドリアと JC-1 色素

ミトコンドリアの機能的状態は細胞毒性の早期の指標となるため、創薬や毒性プロファイリングにおける重要なターゲットとして浮上しています。アポトーシス、ネクローシスおよび進行の遅い変性疾患ではすべて、ミトコンドリア膜を横切る電気化学的勾配の変化(ΔΨm:ATPの産生に必要な電気ポテンシャルの生成を引き起こす)を示します。1991年に導入された生細胞カルボシアニン色素JC -1は、脱分極したミトコンドリア内では緑色に、過分極ミトコンドリアでは赤/橙色に、その蛍光が可逆的に変化することで、ΔΨm の変化を示します。赤色のシグナルは、緑色の JC-1 モノマーが凝集体(赤/橙色を示す)へと凝集した結果です(いわゆるJ会合体の形成)。JC-1は、試験したほとんどの細胞種で有用で、生細胞中のミトコンドリアの健康状態を示す最も信頼できるマーカーの一つです。

特長

本製品は、条件変更で結果が変化するおそれのある細胞培養系や培地の変化に敏感な製剤の投与をする場合などにおいて、条件変更を最小限に抑えて蛍光試薬を送達できます。完全培地中の細胞に in situ で直接 2X濃度の蛍光試薬を添加するプロトコールを用いた場合、多少のバックグラウンドは検出されますが、ほとんどの分析では十分な S/N(signal to noise)比を得ることができます。代わりに、キットに含まれるOpti-Klear ™ 生細胞イメージングバッファー(単品:M1898)を使用することで、バックグラウンドを低減され、CO2の非存在下で少なくとも1-4時間、細胞を維持することができます。Opti-Klear™ 生細胞イメージングバッファーは、重炭酸塩緩衝培地で増殖させた細胞に対し、CO2インキュベーターの外で培地の pH 維持に理想的です。

本キットのJC-1は、便利な1回使用のバイアルで提供され、96ウェルプレートを使用して100 μL 容量で蛍光標識を行う場合、500アッセイ分行うのに充分な試薬が含まれます。

構成内容

  • JC-1 (5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide): 5 バイアル
  • DMSO (dimethylsulfoxide): 1 mL
  • Opti-Klear™ Live Cell Imaging Buffer 5X: 1 x 30 mL

JC-1 による接着細胞の染色プロトコール

(1) 完全培地中での測定

JC-1 による接着細胞の染色プロトコール(培地中)

<詳細>

  1. JC-1, 溶液 A (100X or 0.5mM stock)の調製:
    JC- 1のバイアルに100μlのDMSOを加えてボルテックスし、滅菌15mL遠心管に移します。JC -1は、溶液中で不安定なため、長期間の保存はできません。必要に応じて1回分のバイアルから調製してください。
  2. JC-1, 溶液 B (2X or 10μM)の調製:
    37℃で、溶液A に 5 mLの完全培地を添加します。JC-1が赤色の凝集/沈殿物を形成するのを防ぐために、30秒間ボルテックスしてください。凝集体が残存する場合は、0.22μmフィルターを通してろ過します。 
  3. 細胞からの培養培地の50 %を除去し、等量の溶液Bで置き換えます。
  4. 37℃で30分〜1時間インキュベートします。
  5. モノマー(Em/Ex 514nm / 529nm)とJ会合体(Em/Ex 585nm/ 590nm)の両方の蛍光染色をプレートリーダー、フローサイトメトリー、または落射蛍光顕微鏡で観察します。(FITC、ローダミンのフィルターセットまたは同等のフィルターをご使用頂けます。)
  6. 総ミトコンドリアは、FITCチャネルでの緑色と、ローダミンチャンネルにおける赤/橙を示すJ会合体で示されます。

(2) 培地を除去して測定

JC-1 による接着細胞の染色プロトコール(培地除去)

<詳細>

  1. JC-1, 溶液 A (100X or 0.5mM stock)の調製:
    JC- 1のバイアルに100μlのDMSOを加えてボルテックスし、滅菌15mL遠心管に移します。JC -1は、溶液中で不安定なため、長期間の保存はできません。必要に応じて1回分のバイアルから調製してください
  2. JC-1, 溶液 B (2X or 10μM)の調製:
    37℃で、溶液A に 10 mLの無血清培地を添加します。JC- 1が赤色の凝集/沈殿物を形成するのを防ぐために、30秒間ボルテックスします。凝集体が残存する場合は、 0.22μmフィルターを通してろ過してください。
  3. 細胞から培養培地を吸引除去し、無血清培地で一回洗浄後、溶液Bに置き換えてください。
  4. 37℃で30分〜1時間インキュベートします。
    S/N比の向上のために、解析前に 37℃で 1X Opti-Klear™生細胞イメージングバッファーに置き換えます。1XOpti- Klear™ 生細胞イメージングバッファーの調製には、5X Opti-Klear™ 2 ml に8ml の滅菌水を加えてください。
  5. モノマー(Em/Ex 514nm / 529nm)とJ会合体(Em/Ex 585nm/ 590nm)の両方の蛍光染色をプレートリーダー、フローサイトメトリー、または落射蛍光顕微鏡で観察します。( FITC、ローダミンのフィルターセットまたは同等のフィルターをご使用頂けます。)
  6. 総ミトコンドリアは、FITCチャネルでの緑色と、ローダミンチャンネルにおける赤/橙を示すJ会合体で示されます。

JC-1アッセイ 測定例

JC-1によるFCCP処理Hela細胞の染色
図1.プロトノフォアであるFCCP(carbonylcyanide-p trifluoromethoxyphenylhydrazone:ミトコンドリアの酸化的リン酸化の脱共役剤)上昇にともなう、HeLa細胞での J会合体形成(赤色)の減少。
完全培地中のHeLa細胞をFCCPで30分間処理した後、JC-1を30分間添加した。標準的なFITC/TRITCフィルターセットを使用して40X, 1.3NA 油浸対物レンズで画像化した。

JC-1シグナルの定量によるFCCP阻害の検討
図2.FCCPの濃度増加に伴うJ会合体の減少。図1と同様に細胞を処理した。赤と緑のシグナルの画像の強度を収集し、比率に換算した。

よくある質問 Q&A

【01】 本キットに含まれる Opti-Klear™ を使用する利点は何ですか?

5XのOpti-Klear™生細胞イメージングバッファーは、HEPESベースのイメージングバッファーで、バックグラウンド蛍光を低減させ、37℃で数時間 適切なpHとオスモル濃度の維持します。また、エネルギー源を供給し、蛍光シグナルを維持します。

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参考文献

Smiley ST, Reers M, Mottola-Hartshorn C, Lin M, Chen A, Smith TW, Steele GD Jr, Chen LB. (1991) “Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1.” Proc Natl Acad Sci U S A 88(9):3671-5.


Reers M, Smith TW, Chen LB. (1991) “J-aggregate formation of a carbocyanine as a quantitative fluorescent indicator of membrane potential.” Biochemistry. 30(18):4480-6.


Reers M, Smiley ST, Mottola-Hartshorn C, Chen A, Lin M, Chen LB. (1995) “Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye.” Methods Enzymol. 1995;260:406-17.


Wallace DC. (1999) “Mitochondrial diseases in man and mouse.” Science, 283 (5407): 1482-88.


Mathur A, Hong Y, Kemp BK, Barrientos AA, Erusalimsky JD. (2000) Evaluation of fluorescent dyes for the detection of mitochondrial membrane potential changes in cultured cardiomyocytes.” Cardiovascular Research 46 (1): 126-138.


Salvioli S, Ardizzoni A, Franceschi C, Cossarizza A. (1997) “JC-1, but not DiOC(6)(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess Delta Psi changes in intact cells: Implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis.” FEBS Letters, vol. 411 (1): 77-82.

JC-1 ミトコンドリアアッセイ ‐MarkerGene™‐

MarkerGene™ Dyrect JC-1 Mito Health Assay Kit

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
MarkerGeneTM Dyrect JC-1 Mito Health Assay Kit詳細データ MGT M1890 1 KIT
¥85,000

[単品販売]Opti-Klear™ 生細胞イメージングバッファー

バックグラウンドの蛍光を低減する、HEPESベースのイメージングバッファーです。

品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
Opti-KlearTM Live Cell Imaging Buffer詳細データ MGT M1898 30 ML
[5X concentrate]
¥15,000

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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