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記事ID : 16885
研究用

免疫エフェクター細胞による標的死細胞を特異的に測定KILR® 細胞毒性アッセイ
DiscoverX社:免疫エフェクター細胞による標的死細胞を特異的に測定

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がん免疫治療薬は、従来備わっている免疫システムを利用して、がん細胞を死滅させるがんの新しい治療法です。このようながん免疫治療薬物を分析するためには、免疫エフェクター細胞と共培養して標的がん細胞の細胞死を検出する必要があります。放射性または漏出性色素では、免疫エフェクター細胞との共培養内から標的細胞死を検出することが困難です。また、一般的な細胞死アッセイでは、特異的にがん細胞死とエフェクター細胞死を区別する手法はありません。

DiscoverX社の KILR® アッセイは、標的細胞内部にタンパク質タグが発現されており、標的細胞の細胞死でのみ、タグが細胞上清に放出されます。このタグを利用して化学発光を検出する本アッセイは、従来のアッセイの欠点を克服し、標的細胞の細胞死を特異的かつ簡便に検出することができます。

ご利用方法は本 KILR® 細胞株を利用するか、または KILR® レトロウイルス粒子を使ってカスタム KILR® 細胞株を構築する2つの手法があります。

特長

  • 高い特異性:標的死細胞のシグナルのみを検出
  • 簡便:KILR® 検出試薬を添加して化学発光を測定するだけのシンプルなプロトコール
  • 超高感度:高い再現性、かつ最少75死細胞から検出可能
  • フレキシブルなプロトコール:細胞毒性試験を30分から72時間で実施可能

アッセイ原理とデータ

アッセイ原理

Fig.1 アッセイ原理

A.標的細胞は、DiscoverX社独自の EFC 技術の β-galactosidase レポーター断片である ProLabel® (ePL) でタグ付けしたハウスキーピング遺伝子を安定発現させ、KILR® 検出試薬には、もう一方の β-galactosidase 断片である EA を強制発現させている(Fig1-A)。この活性 β-galactosidase により加水分解された基質の化学発光シグナルを測定する。

B(左図). 免疫エフェクター細胞存在下で生存している健常な標的細胞に、KILR® 検出試薬を添加した場合は、KILR® レポータータンパク質は生細胞の無傷な細胞膜から培地へ流出できない。
B(右図). 免疫エフェクター細胞によって標的 KILR® 細胞が死滅しており、KILR® レポータータンパク質が培地中に放出されている。KILR® 検出試薬の添加により、培地中のレポータータンパク質が認識され死細胞数と比例して化学発光が産生される。共培養内に存在する免疫エフェクター細胞は、他種の細胞株が死滅した場合であってもアッセイの出力に影響を及ぼさないため、KILR® アッセイは、同時培養アッセイ中の標的細胞死を特異的に検出可能である。

高感度・低毒性・高い再現性

最少75死細胞/wellから検出可能

Fig.2 最少75死細胞/well から検出可能
ヒト初代 PBMCs と結腸がんの抗 EGFR 剤であるセツキシマブとともに KILR® H322 細胞を様々な密度で播種し、ADCC 応答を測定した。セツキシマブは抗体が免疫細胞を活性化して標的がん細胞を殺傷するという ADCC 活性を示すことが知られている。標的細胞死は、測定シグナルと界面活性剤により可溶化された細胞による総シグナルとの比率である %Lysis で示される。
本アッセイでは、 KILR® 細胞を様々な密度で各ウェルに播種し ADCC の反応を測定した。最も播種密度の低い青色のデータ(2,500 cells/well)では、KILR® H322 細胞より 3% の可溶化(75 cells/well)を再現性よく検出したことが示唆される。

 

KILR®細胞株を用いたADCCアッセイ例

Fig.3  KILR® 細胞株を用いた ADCC アッセイ例
A. SKBR3 細胞におけるトラスツズマブ(Herceptin®)の細胞毒性データを示した。細胞はハーセプチン(抗ErbB2/Her2)の用量反応によりオプソニン化し、NK細胞とともに培養した。トラスツズマブは ADCC 応答を誘引する抗体として知られ、ADCC を再現性よく検出できることが示された。
B. リツキシマブ(抗CD20)の用量反応によりオプソニン化され、NK細胞とともに培養された CD20+ ARH-77 標的細胞におけるリツキシマブの ADCC データを示した。3.6 ng/mL における EC50 は、他の ADCC アッセイ系(例:クロム-51放出、ユーロピウム)を用いて得られた EC50 と一致し、同等の薬理作用や ADCC 検出能力がある、より簡便化された手法であることを示した。

 

プロトコール

検出試薬を添加して読み取るだけの簡便なプロトコールで、一般的なルミノメーターを用いて測定できます。KILR® アッセイは、試験前に標的細胞をロードしたり、放射性物質を使用したりする必要がないため、実験ステップを減らし効率化することができます。

51Cr放出アッセイとの比較

Fig.4 51Cr放出アッセイとの比較

 

多様なアプリケーション

KILR® アッセイは、以下のような広範囲の用途に利用することができます。

  • 抗体依存性細胞傷害(ADCC)
  • 補体依存性細胞傷害(CDC)
  • 抗体依存性細胞食作用(ADCP)
  • 二重特異性抗体介在型T細胞リダイレクト
  • キメラ抗原受容体T細胞(CAR-T)
  • 抗体薬物複合体(ADC)

KILR® レトロウイルス粒子を用いたアッセイ

KILR® レトロウイルス粒子は、ほぼ全ての分裂細胞株に KILR® レポーターコンストラクトを安定に導入することが可能です。そのため、お客様ご自身で目的のターゲットが発現されている細胞株を用いて KILR® アッセイを構築できます。構築された KILR® アッセイ細胞株は、RI(放射性同位体)や染料を使わずに、共培養中のエフェクター細胞の細胞死も混在する中で、標的がん細胞のみの細胞死を特異的に検出することができます。

アッセイ概要

Fig.5 アッセイ概要

 

細胞リスト

Product Configuration
RETROPARTICLES  
KILR® Retroparticles for Suspension Cells (Neomycin) Retroviral Particles
KILR® Retroparticles for Adherent Cells (Neomycin) Retroviral Particles
KILR® Retroparticles for Adherent & Suspension Cells (Neomycin) Retroviral Particles
KILR® CELL LINES  
KILR® ARH-77 Cell Line Stable Cell Line
KILR® SKBR3 Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® H322 Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® NCI-N87 Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® A549 Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® Ramos Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® SKOV3 Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® NCI-H292 Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® Daudi Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® U2OS-EGFR Cell Line Stable Cell Line
KILR® THP-1 Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® Raji Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® WIL2-S Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® MCF7 Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® MOLT-4 Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® EL4 Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® A498 Cell Pool Stable Cell Pool
KILR® MDA-MB-231 Cell Pool Stable Cell Pool

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