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青色ホルマザンで、フェノールレッドの干渉を最小限に LDH-Blue™ Plus 比色法LDH細胞毒性アッセイ

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メーカー名：InvivoGen

背景

LDH-Blue™ Plusは、損傷または溶解した細胞の細胞培養上清中における乳酸脱水素酵素（LDH）活性を測定する、比色法アッセイです。従来品よりも安定性が向上しています。本キットは、青色のホルマザン生成物を生じる基質を採用しており、培地の色を淡赤色から青～紫色へと変化させます。赤色のホルマザンを生成する従来のLDHアッセイとは異なり、この青色のシグナルは培養液中のフェノールレッドと明確に区別できるため、目視でも簡単に検出（判別）が可能です。
細胞毒性アッセイ、免疫細胞を介した細胞傷害（キリング）アッセイ、インフラマソーム研究、および薬剤毒性スクリーニングに最適です。

特長

明確な目視検出：フェノールレッドと明確に区別できるシグナル
低いベースラインシグナル：細胞の自然放出によるLDHのバックグラウンドを最小限に抑制
高い直線性：複数の細胞種において信頼性の高い定量が可能
正確な定量：蛍光法による生死細胞（Live/Dead）染色と同等の性能
広いダイナミックレンジ：低レベルから高レベルまでの細胞毒性を検出可能

構成内容

Reagent Mix (凍結乾燥品)
Assay Buffer
Lysis Buffer
Stop Solution

プロトコル(概要)

図１．LDH-Blue™ 細胞毒性アッセイの概要

構成品を室温に戻す。(～20分)
反応溶液を調製する。
培養上清50uL、及びコントロールを別の96穴プレートに移す。
反応溶液を50uL加える。
室温で 30 分間インキュベート（遮光）。
停止溶液を50uL加える。
650nmの吸光度を測定する。

原理

仕様

サンプルタイプ	細胞培養上清
検出方法	比色法
サンプル量	50µL (96穴プレートを使用の場合)
アッセイ時間	30分

データ例

図3．LDH-Blue™ Plusを用いたキネティックおよびエンドポイント測定
段階的に希釈したTHP1-Null2細胞を、溶解バッファー（Lysis Buffer）とともに30分間培養した。インキュベーション後、LDH-Blue™ Plusを用いて上清中のLDH放出をモニターした。酵素反応はウェルにReagent Mix Solutionを添加するとすぐに開始され、時間の経過とともに進行し、培地の色は、LDH活性に比例して青～紫色へと変化した。 Stop Solutionを添加すると反応が停止し、それ以降は時間の経過による色の変化は起こらなくなった。 (Stop Solutionを添加後、6時間以内に650 nmの吸光度を測定することが推奨されている)

図4．LDH-Blue™ Plusを用いたパイロトーシス細胞死の検出
THP1-Null2細胞を1 µg/mlのLPS-EK (Lipopolysaccharide from E. coli K12株) で3時間プライミング後、 NLRP3インフラマソーム誘導因子であるNigericinを濃度を変えて添加した。誘導6時間後に、上清中のLDH放出量をプロトコルに従い定量した。結果は、陽性コントロールで測定した最大LDH放出量に対する百分率（平均値 ± SEM）として示した。

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
LDH-Blue^TM Plus	ING	REP-LDHV2-1	200 TEST	￥27,000
LDH-Blue^TM Plus	ING	REP-LDHV2-5	1000 TEST [5 x 200 tests]	￥74,000
LDH-Blue^TM Plus	ING	REP-LDHV2-50	10000 TEST [50 x 200 tests]	お問い合わせ