記事ID ： 45097

定量PCRにより細胞性免疫応答を評価 LeukoComplete™ 細胞性免疫検出キット

メーカー名：ミナリスメディカル株式会社

本キットは、少量の全血に抗原となるウイルス断片ペプチド等を添加し、専用のプレートを組み合わせることで、刺激を受けた特異的T細胞中の遺伝子発現変動を定量PCRにより細胞性免疫応答として評価する独自の研究用検査キットです。

LeukoComplete(TM) 細胞性免疫検出キット

本商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

特長

図1. 操作の概要図

　本キットは、全血が使用可能であり、Antigen-Coated Plate for SARS-CoV-2 (オプション製品)を用いた場合、4時間の抗原刺激で免疫応答を検出することができます。また、刺激後の全血は凍結保管することができます。
　Leukocyte Isolation Plateは、全血中の白血球を独自のフィルター素材で捕捉します。高い白血球親和性と多孔性により、白血球を高収率で再現性よく分離することができます。
　分離された白血球は、溶解バッファーに含まれるグアニジンチオシアネートの存在下で、Leukocyte Isolation Plate上で直接溶解され、即座にリボヌクレアーゼを不活性化し、インタクトなRNAの単離を確実にします。
　白血球溶解液をmRNA Capture Plateに移した後、各ウェルに固定化された一本鎖オリゴ(dT)とのハイブリダイゼーションにより、ポリ(A)+ RNAが単離されます。この方法の利点は、従来の磁気ビーズやグラスファイバー法よりもサンプル間の再現性が高く、取り扱いが容易なことです。
　mRNA Capture Plateにハイブリダイズされたポリ(A)+ RNAは、同じウェル内で逆転写酵素及び、ランダムヘキサマーによりcDNAを合成することが可能です。合成されたcDNAは、溶液中に置換、放出され、リアルタイムPCRによりターゲット遺伝子の発現レベルの変動測定に利用することが可能です。

全血のまま少量の検体・短時間の抗原刺激で免疫応答を検出可能
免疫応答を高感度かつ複数の遺伝子マーカーで評価可能
キット一体化のため検出結果の施設間差が低減可能（標準化しやすい）
汎用のリアルタイムPCR測定装置を用いて評価可能（専用機器の購入が不要）

構成内容

・LeukoComplete™ Plate Kit　(品番：11110)
・LeukoComplete™ Plate Kit (with Antigen Coated Plate for SARS-CoV-2) 　(品番：11111)※1

構成品	容量
Antigen-Coated Plate for SARS-CoV-2 ※1	1 plate
Leukocyte Isolation Plate (filter plate)	1 plate
mRNA Capture Plate	1 plate
Lysis Buffer	6 mL × 1本
Proteinase K	30 µL × 1本
TCEP	300 µL × 1本
Wash Buffer A	30 mL × 1本
Wash Buffer B	50 mL × 1本
PT Buffer	15 mL × 1本
Deep Well Plate	1 plate
Aluminum Seal	1枚

※1 LeukoComplete™ Plate Kit (with Antigen Coated Plate for SARS-CoV-2)に含まれます。

・LeukoComplete™ RT and PCR Kit　(品番：11120)

構成品	容量
RT Buffer	1.5 mL × 2本
M-MLV Reverse Transcriptase	40 µL × 1本
RNase Inhibitor	10 µL × 1本
ACTB Primer Mix	100 µL × 1本
IFNG Primer Mix	100 µL × 1本

※2 PCR酵素は別途購入ください。
[SsoAdvanced™ Universal qPCR Supermix (Bio-Rad社　品番：1725270）を推奨]

製品データ

基礎データ

図2. 全血量と遺伝子量の直線性
全血を50 µLから1/2量ずつ減らしながらフィルタープレートに添加しLeukoComplete™により、コントロール遺伝子を検出。血液量に依存した良好な直線性が得られることを確認しました。

図3. 全血への抗原刺激時間とレスポンスの関係
全血にSARS-CoV-2由来ペプチドプールで刺激を行い、刺激時間による標的遺伝子(IFNG)の発現量を検討。4時間の抗原刺激で測定が可能であることを確認しました。

ヒト臨床検体を用いた製品使用例

図4. 従来法 (ELISpot法)との性能比較
LeukoComplete™を用いて新型コロナウイルスに対する獲得免疫を調べる検出法としての適性を評価。全血によるLeukoComplete™を用いた検出法は、白血球を用いたELISpot法と同等の性能であることを確認しました。

図5. 新型コロナワクチン接種後の獲得免疫モニタリング
3回ワクチン接種後3～9か月後の獲得免疫の推移を検討。ワクチン接種後9か月でも細胞性免疫が維持される傾向であることを確認しました。

測定実績のある遺伝子

ACTB、IFNG以外の遺伝子のプライマー情報についてはお問合せください。

参考文献

Mitsuhashi M, Tomozawa S, Endo K, Shinagawa A. Quantification of mRNA in whole blood by assessing recovery of RNA and efficiency of cDNA synthesis. Clin Chem. 2006 Apr;52(4):634-42.
Mitsuhashi M. Ex vivo simulation of leukocyte function: stimulation of specific subset of leukocytes in whole blood followed by the measurement of function-associated mRNAs. J Immunol Methods. 2010 Dec 15;363(1):95-100.
Saito et al. “Rapid and high throughput assessment of cellular immunity against SARS-CoV-2 based on the ex vivo activation of genes in leukocyte assay with whole blood.” Biochemical and Biophysical Research Communications (2023), doi: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2023.149398

LeukoComplete™
A Cell-mediated immune response assay kit based on RT-qPCR

品名	メーカー	品番	包装	希望販売価格
LeukoComplete^TM Plate Kit, Human	MIN	11110	1 KIT [for 1 plate]	￥78,000
LeukoComplete^TM Plate Kit(with Antigen Coated Plate for SARS-CoV-2), Human	MIN	11111	1 KIT [for 1 plate]	￥192,000
LeukoComplete^TM RT and PCR Kit, Human	MIN	11120	1 KIT [for 1 plate]	￥48,000