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本キットは、少量の全血に抗原となるウイルス断片ペプチド等を添加し、専用のプレートを組み合わせることで、刺激を受けた特異的T細胞中の遺伝子発現変動を定量PCRにより細胞性免疫応答として評価する独自の研究用検査キットです。
本商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。
【目次】
記事ID ： 45097
定量PCRにより細胞性免疫応答を評価 LeukoComplete™ 細胞性免疫検出キット
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特長
本キットは、白血球を含む試料から、T細胞をはじめとする免疫細胞由来の遺伝子を調製するためのキットです。本キットにより、試料中の白血球からのmRNAの簡便な抽出と精製、精製mRNAの逆転写反応によるcDNAの合成が可能となり、合成したcDNAは、定量PCRにより、相対的な遺伝子発現変動の評価に用いることができます。本キットは遺伝子検出に基づく細胞性免疫評価法である、Ex vivo Activation of Gene in Leukocyte ；EAGL法の実施に適しています。独自設計の2種類のプレート“Leukocyte Isolation Plate”と“mRNA Capture Plate”により、高い再現性とスループットを実現します。
| 使用用途 |
|
|---|---|
| 作業時間 | 180分＋抗原刺激時間 |
| サンプル種 |
|
| 最終産物 | cDNA 30µl |
| 検出対象 | コントロール遺伝子（ヒト、マウス）
|
| 測定機器 |
|
| アプリケーション |
|
構成内容
| 構成品 | 容量 |
|---|---|
| PT Buffer | 15 mL × 1本 |
| Leukocyte Isolation Plate (Filter Plate) | 1枚 |
| Deep Well Plate | 1枚 |
| Proteinase K | 30 µL × 1本 |
| TCEP | 300 µL × 1本 |
| Lysis Buffer | 6 mL × 1本 |
| mRNA Capture Plate | 1枚 |
| Wash Buffer A | 30 mL × 1本 |
| Wash Buffer B | 50 mL × 1本 |
| Aluminum Seal | 1枚 |
| M-MLV Reverse Transcriptase | 40 µL × 1本 |
| RNase Inhibitor | 10 µL × 1本 |
| RT Buffer | 1.5 mL × 2本 |
| 構成品 | 容量 |
|---|---|
Antigen Coated Plate for SARS-CoV-2 ※1 |
1枚 (24 test分) |
※1 抗原として、SARS-CoV-2スパイクタンパク質由来のオーバーラップペプチド (15アミノ酸、11オーバーラップ) が塗布されています。ブランク、抗原2種、ポジティブコントロールの4ウェルで1テストとなります。
| 構成品 | 容量 |
|---|---|
| Primer Mix ※2 | 100 µL × 1本 |
| PCR Enzyme Mix | 500 µL × 1本 |
※2 目的の遺伝子ごとに品番及び含まれるPrimer Mixが異なります。
遺伝子抽出性能
- 各種サンプル（ヒト血液、ヒトPBMC、マウス血液、マウス脾臓）の添加量とコントロール遺伝子の発現量の関係 -
図1.
ヒト血液、マウス血液を50 mL、ヒトPBMC、マウス脾臓を5×105 cellsから2倍ずつ段階希釈を行い、LeukoComplete™ を用い白血球由来のmRNAを抽出／cDNA合成を行った。合成したcDNAをテンプレートとして、リアルタイムPCRによりハウスキーピング遺伝子を測定した。
いずれのサンプル種を対象にした場合も、LeukoComplete™ により高い直線性（R2＞0.9）を有しながら遺伝子を抽出できた。
対象遺伝子の例
- 抗原刺激時間に応じた免疫関連遺伝子（IFNG, IL2, IL4, GM-CSF）の発現変動解析 -
図2.
100 µLのヒト新鮮血とCEFペプチドプールまたはPBSを混合し、0〜24時間37℃で培養後、血液を凍結保管した。血液を融解後、LeukoComplete™ により遺伝子を抽出し、各種遺伝子の発現変動を算出した（各色の折れ線は異なるドナーの結果を表す（n=4））。
log2FC = - （標的遺伝子のCt値［抗原刺激あり］ - コントロール遺伝子のCt値［抗原刺激あり］）
- （標的遺伝子のCt値［抗原刺激なし］ - コントロール遺伝子のCt値［抗原刺激なし］）
細胞性免疫評価法の比較
- 同一検体を用いたELISpot法及びICS (Intra Cellular Staining) 法との比較 -
図3.
COVID-19ワクチン接種者21例の新鮮血またはPBMCを使用し、SARS-CoV-2スパイクタンパク質のオーバーラップペプチドに対する細胞性免疫応答を評価した。LeukoComplete™ ではIFN-γ遺伝子（IFNG）、ELISpot法ではIFN-g、ICS法ではCD3陽性IFN-g分泌細胞を測定対象とした。
いずれの評価法の測定値はR=0.5程度であり、LeukoComplete™ を用いた遺伝子検出に基づく細胞性免疫評価法により、既存法に近しい評価が可能であることが示唆された。
LeukoComplete™ はカットオフを上回るサンプル数がICS法よりも多く、高感度であることが示唆された（ELISpot法と同数）。
解析方法の例
- 比較Ct法：抗原刺激の有無による相対的なIFN-g遺伝子変動の評価 -
図4.
コントロール遺伝子による発現量のノーマライズにより、各ウェル間の遺伝変動を相対比較可能とした。
ΔΔCt（log2Fold Change）= - （標的遺伝子のCt値［抗原刺激あり］ - コントロール遺伝子のCt値［抗原刺激あり］）
- （標的遺伝子のCt値［抗原刺激なし］ - コントロール遺伝子のCt値［抗原刺激なし］）
| Species | Genes | Positive control antigen | Cutoff of Ct | |||||
| PMA/IM | PHA | LPS | ConA | CEF | ||||
| Human | IFNG | +++ | ++ | +++ | ++ | + | 32 > | |
| IL2 | +++ | ++ | +/- | +/- | N.D. | 34 > | ||
| TNFSF2 | ++ | + | ++ | + | +/- | 32 > | ||
| IL4 | +++ | ++ | N.D. | N.D. | N.D. | 34 > | ||
| IL5 | ++ | +/- | N.D. | N.D. | N.D. | 34 > | ||
| IL6 | ++ | ++ | +++ | ++ | N.D. | 34 > | ||
| IL10 | ++ | + | ++ | +/- | N.D. | 34 > | ||
| IL13 | +++ | ++ | +/- | +/- | N.D. | 34 > | ||
| CSF2 | +++ | ++ | ++ | ++ | N.D. | 32 > | ||
| CXCL 10 | N.D. | ++ | ++ | ++ | ++ | 32 > | ||
| Mouse | IFNG | +++ | +/- | +/- | ++ | ― | ― | |
| IL 10 | +++ | ++ | N.D. | ++ | ― | ― | ||
| IL 17 | ++ | N.D. | +/- | N.D. | ― | ― | ||
| Final conc. of each positive control |
PMA: 100 ng/mL IM: 1000 ng/mL |
10-100 µg/mL | 1-100 µg/mL | 100 µg/mL | 1-10 µg/mL | Instrument: ABI Fast7500 Threshold line: 0.1 |
||
Human: 100 mL of fresh blood was mixed with each antigen and incubated for 4hr under 37℃.
Mouse: 106 cells of spleen was mixed with each antigen and incubated for 4hr under 37℃.
*標記外の遺伝子のプライマーが必要な際はお問い合わせください。
| Reagent | Abbreviation |
| PMA | Phorbol 12-myristate 13-acetate |
| IM | Ionomycin |
| PHA | Phytohemagglutinin |
| LPS | Lipopolysaccharide |
| ConA | Concanavalin A |
| CEF | CEF control peptide pool |
| Rank | Mean relative mRNA |
| expression (log2FC, n=12) | |
| +++ | > 8 |
| ++ | 5-8 |
| + | 3-5 |
| +/- | 1.5-3 |
| N.D. | < 1.5 |
| ー | Not evaluated |
参考文献
- Mitsuhashi M, Tomozawa S, Endo K, Shinagawa A. Quantification of mRNA in whole blood by assessing recovery of RNA and efficiency of cDNA synthesis. Clin Chem. 2006 Apr;52(4):634-42.
- Mitsuhashi M. Ex vivo simulation of leukocyte function: stimulation of specific subset of leukocytes in whole blood followed by the measurement of function-associated mRNAs. J Immunol Methods. 2010 Dec 15;363(1):95-100.
- Saito et al. “Rapid and high throughput assessment of cellular immunity against SARS-CoV-2 based on the ex vivo activation of genes in leukocyte assay with whole blood.” Biochemical and Biophysical Research Communications (2023), doi: https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2023.149398
- Saito et al. “Longitudinal monitoring of cellular immunity by the ex vivo activation of genes in leukocytes (EAGL) assay highlights potential markers of mRNA COVID-19 vaccine efficacy against breakthrough symptoms” Vaccine (2025), doi: https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2025.127942
| 品名 | メーカー | 品番 | 包装 | 希望販売価格 |
|---|---|---|---|---|
LeukoCompleteTM Plate and RT Kit |
MIN | 11130 | 1 KIT [for 1 plate] |
￥125,000 |
| LeukoCompleteTM Antigen Coated Plate (for SARS-CoV-2) |
MIN | 11140 | 1 PLATE |
￥113,000 |
LeukoComplete™ Gene Detection Kit
商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。
※ 表示価格について
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