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研究用

Illumina社およびLife Technologies社(Ion Torrent™, SOLiD® システム)次世代シーケンシング用ライブラリ調製キットLexogen社 SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit

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SENSE mRNA-Seq Library Prep Kitは、正確な遺伝子発現プロファイリング、トランスクリプトーム配列決定、アンチセンス転写物や重複遺伝子の発見および定量を目的とした、完全にストランド特異的なmRNA-Seqライブラリ調製用キットです。

Ion Torrent™は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社の登録商標です。
SOLiD®は、サーモフィッシャーサイエンティフィック社の登録商標です。

特長

  • 優れたストランド特異性
    RNAやcDNAの断片化を利用したプロトコールでは、鋳型転換によりアンチセンスの人為産物が生ずる可能性がありますが、本製品で使用している鎖置換型終止/ライゲーション技術ではこの人為産物がほぼ生じません。これより、例学的なストランド特異性(> 99.9%)と実験ノイズの減少が実現し、信頼性の高いアンチセンス転写物検出および定量が可能となりました。
  • 短時間で実施可能
    Total RNAから次世代シーケンシングに利用可能なライブラリが4時間以内(実際の作業時間は半分以下)で調製できます。RNA抽出、ライブラリ調製、および品質管理も含めて1日で実施できます。
  • 全工程を1つの溶液で実施するシンプルプトロコール
    ライブラリ増幅、サイズ選択、および精製に、追加のキットや試薬は必要ありません。さらに、LEX社の鎖置換型終止/ライゲーション技術を利用するため、時間を要するRNAやcDNA断片化を行う必要がありません。
  • 少ない初期total RNA量で実施可能
    mRNAの豊富な組織(腎臓、肝臓、脳など)の場合、500ng程度のtotal RNAを用いて実験をはじめます。mRNA含有量の低い組織(肺、心臓など)の場合、2μg程度のtotal RNAを使用します。
    簡便なマルチプレックス
    オプションのSENSE mRNA-Seq Barcode kit (品番:003.08A〜003.08H, 003.24A〜003.24H(Illumina社システム用)、品番:005.08A〜005.08H, 005.24A〜005.24H (Life Technologies社 SOLiD® システム用)、品番:007.08A, 007.24A(Life Technologies社 Ion Torrent™ システム用))を利用する場合、最多で1152ものライブラリのマルチプレックスが可能です。
  • 効率よくrRNAを除去
    本製品には総合的なpoly(A) mRNA選択工程があり、細胞質のリボソームRNAを実質的に除去できます(Universal Human Reference RNAの場合、配列読み取りの0.001%未満)。追加でセレクションや除去キットを使用する必要がなく、労力と費用の節約になります。
  • 配列読み取りの長さが種々異なるものに対応したライブラリ
    個々の実験において、全ての転写物をよく再現し均等に被覆するために、選択した配列読み取りの長さに適したサイズをもつライブラリであることが重要です。RT/ライゲーションおよび精製ステップで使用する緩衝液を適切に調節することで、Illumina用SENSEライブラリのサイズ調整を行います。
  • 転写物被覆度が均一
    SENSEライブラリは転写物の被覆度が均一(図.1参照)、かつ変動計数が低い(平均0.4程度)。
転写物の被覆度が均一かつ低い変動計数
図.1 転写物の被覆度が均一かつ低い変動計数
Illumina社システム用SENSE mRNA-Seq library prep kitより得たライブラリで発現がみられた転写物のうち、上位500種のプールにおける比例累積被覆度プロット

SENSE mRNA-Seq Library Prep Kitワークフロー

本製品 は、全てが1つのキットで完結するmRNA-Seqライブラリ調製プロトコールが特長です。ほとんどの作業を磁気ビーズ上で行うため、自動化が可能かつ精製時間が短縮できます。作業の流れが簡潔なプロトコールで、3つの主なステップで構成されています。

poly(A)セレクションステップでは、total RNAサンプルを短時間熱処理して二次構造を分離し、効率のよいハイブリダイゼーションを促進させます。変性させたtotal RNAを洗浄済みビーズとともにインキュベートします。ビーズはポリアデニル化したRNAとのみ結合し、poly(A)テールを持たないRNAはその後の工程で洗い流されるため、poly(A) RNAのみがビーズにハイブリダイズされて残ります。非常に特異性の高いビーズを利用したpoly(A)セレクションステップにより、細胞質のrRNA, tRNA, および他のポリアデニル化されないRNA群がほぼ完全に除去できます。

ライブラリ作製は、LEX社独自の鎖置換型終止/ライゲーション技術を利用します。スターター/ストッパー ヘテロ二量体混合物が磁気ビーズに結合しているpoly(A) RNAとランダムにハイブリダイズします。同一チューブ内で逆転写反応とライゲーション反応を行い、隣接するハイブリダイズしたヘテロ二量体へとスターターを伸長させ、新しく合成されたcDNA挿入配列をストッパーに連結させます。挿入配列の大きさはスターターとストッパー結合部位の距離によって決まるため、RNAやcDNAの断片化を必要としません。2番目の鎖を合成している間に、RNAは加水分解され、ライブラリは二本鎖DNAとなります。二本鎖ライブラリをカラム精製し、磁気ビーズと2番目の鎖の合成反応成分を除去します。

ライブラリ増幅を行い、クラスター産生に必要な完全なアダプター配列を付加し、かつ品質管理や配列決定に十分な量を生成します。構築したライブラリを精製して定量に影響を及ぼすPCR成分を除去します。
ミクロキャピラリ電気泳動や定量PCRといった一般的なプロトコールを利用してライブラリの定量を行うこともできます。作製したライブラリには、シングルエンドまたはペアエンド型のシーケンシング試薬をご利用頂けます。

Ion Torrent™用SENSEキットに含まれるスターター/ストッパーは、その他のシステムで問題となるようなヘテロ二量体構造をとりません。

SENSE mRNA-Seq Library Prep Kitのワークフロー
図.2 SENSE mRNA-Seq Library Prep Kitのワークフロー

マルチプレックス

本製品を使用して作製したSENSEライブラリは容易にマルチプレックスできます。Illumina社システムとSOLiD®システムの配列決定用にはライブラリ調製のPCR増幅ステップで、96種の外部バーコードを挿入することができます。また、Illumina社システムとIon TorrentTMシステムの配列決定用に、逆転写反応/ライゲーションステップにおいて各配列読み取りの前方に12種の内部バーコードを挿入することもできます。

■ Illumina社システム用マルチプレックス

Illumina社システム用サンプルのマルチプレックスには外部バーコードと内部バーコードをご利用頂けます。外部バーコードの場合、内部バーコードと異なり配列決定用の反応を別途行う必要があります。外部バーコードと内部バーコードを組み合わせて使用する場合、最大1152サンプルのマルチプレックスを行うことが可能です。バーコードおよび使用法の詳細は 製品マニュアル をご参照ください。

 

・ 外部バーコード
SENSE External Barcode Kits (品番:003.08A〜003.08Hまたは 003.24A〜003.24H)を用いてライブラリ増幅を行い、外部バーコードを導入します。Illumina社フローセル上でレーンごとに最大96サンプルの配列決定を行うことができます。外部バーコードは6塩基で、バーコードごとに8または24反応可能なバーコードキットをご用意しています。

External Barcode Kit A (1-12)  External Barcode Kit B (13-24) External Barcode Kit C (25-36) External Barcode Kit D (37-48) External Barcode Kit E (49-60) External Barcode Kit F (61-72) External Barcode Kit G (73-84) External Barcode Kit H (85-96)
PCR01: ACATTA PCR13: GAACCT PCR25: ACAACG PCR37: AGTTGA PCR49: AGGCAT PCR61: GAAGTG PCR73: AACAAG PCR85: TTGGTA
PCR02: GGTGAG PCR14: CGGTTA PCR26: GCGCTG PCR38: GACGAT PCR50: ACCTAC PCR62: AGAATC PCR74: AACCGA PCR86: CAACAG
PCR03: CGAAGG PCR15: AACGCC PCR27: CAAGCA PCR39: CACACT PCR51: TGGATT PCR63: GCGAAT PCR75: TGGCGA PCR87: CAATGC
PCR04: AAGACA PCR16: CAGATG PCR28: GTTACC PCR40: CAGCGT PCR52: GCAGCC PCR64: CGATCT PCR76: CACTAA PCR88: GGAGGT
PCR05: TAATCG PCR17: GATCAC PCR29: CTCTCG PCR41: TGCTAT PCR53: CGCCTG PCR65: CATCTA PCR77: AAGCTC PCR89: CAGGAC
PCR06: CGCAAC PCR18: CGCGGA PCR30: CCAATT PCR42: TCTTAA PCR54: CCGACC PCR66: AAGTGG PCR78: TACCTT PCR90: GGCCAA
PCR07: AATAGC PCR19: CCTAAG PCR31: TTCGAG PCR43: CCGCAA PCR55: TATGTC PCR67: TGCACG PCR79: CTAGTC PCR91: CTCATA
PCR08: TTAACT PCR20: GGCTGC PCR32: CGTCGC PCR44: CTCCAT PCR56: TGACAC PCR68: TCGTTC PCR80: AATCCG PCR92: CCTGCT
PCR09: AATGAA PCR21: ACCAGT PCR33: TGTGCA PCR45: GTCAGG PCR57: ACAGAT PCR69: ACACGC PCR81: GTGTAG PCR93: GGTATA
PCR10: GATTGT PCR22: GTGCCA PCR34: ACCGTG PCR46: ACGTCT PCR58: AGACCA PCR70: GTAGAA PCR82: ACTCTT PCR94: TTCCGC
PCR11: ATAAGA PCR23: AGATAG PCR35: ATACTG PCR47: GAGTCC PCR59: GCTCGA PCR71: AGTACT PCR83: TCAGGA PCR95: TAGGCT
PCR12: GCCACA PCR24: TCGAGG PCR36: ATGAAC PCR48: GACATC PCR60: ATGGCG PCR72: GCATGG PCR84: ATTGGT PCR96: ATATCC

 

・ 内部バーコード
内部バーコードは、SENSE in-line Barcode Kitライブラリ調製中に導入でき、Illumina社フローセルでレーンごとに最大12サンプルまで配列決定できます。バーコード化する場合、通常の逆転写反応とライゲーション時に使用するスターター/ストッパー へテロ二量体ではなく、バーコードキットに付属のスターター/ストッパーミックスを利用します。配列読み取りの最初の5塩基にバーコードが含まれます。内部バーコードキットはバーコードあたり8または24反応可能な製品をご用意しています。

Starter/Stopper Heterodimer Barcode
ST* none
ST1 CTACG
ST2 AACGT
ST3 GCTTC
ST4 TGGAA
ST5 TTCAG
ST6 GAGGA
ST7 ACTCT
ST8 CGATC
ST9 TGCGC
ST10 GATCG
ST11 ATAAT
ST12 CCGTA
品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit V2 for Illumina詳細データ LEX 001.24 24 RXN
¥285,000
SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit V2 for Illumina詳細データ LEX 001.08 8 RXN
¥108,000

■ Ion Torrent™ システム用マルチプレックス

SENSE In-line Barcode Kit (品番:007.08Aまたは 007.24A)を用いてライブラリ調製を行い、内部バーコードを導入します。単一のイオンチップ上で最大12サンプルまで配列決定できます。バーコード化する場合、通常の逆転写反応とライゲーション時に使用するスターター/ストッパー混合物ではなく、バーコードキットに付属のスターター/ストッパー混合物を利用します。バーコードは9塩基長(+4塩基CGAT)で配列読み取りの最初の17塩基内に位置します(TCAG - バーコード- CGAT)。
バーコードおよび使用法の詳細は 製品マニュアル をご参照ください。

Starter/Stopper Mix Barcode
ST* None
ST1 CTAAGGTAA
ST2 TAAGGAGAA
ST3 AAGAGGATT
ST4 TACCAAGAT
ST5 CAGAAGGAA
ST6 CTGCAAGTT
ST7 TTCGTGATT
ST8 TTCCGATAA
ST9 TGAGCGGAA
ST10 CTGACCGAA
ST11 TCCTCGAAT
ST12 TAGGTGGTT
*basic SENSE kitに含まれる
品名 メーカー 品番 包装 希望販売価格
SENSE mRNA-Seq Barcode Kit for Ion Torrent (1-12), set A詳細データ LEX 007.24A 24 RXN
[24 rxn/barcode]
¥86,000
SENSE mRNA-Seq Barcode Kit for Ion Torrent (1-12), set A詳細データ LEX 007.08A 8 RXN
[8 rxn/barcode]
¥32,000
SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit for Ion Torrent詳細データ LEX 006.24 24 RXN
¥285,000
SENSE mRNA-Seq Library Prep Kit for Ion Torrent詳細データ LEX 006.08 8 RXN
販売終了

商品は「研究用試薬」です。人や動物の医療用・臨床診断用・食品用としては使用しないように、十分ご注意ください。

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