細胞内cAMP変化を測定するために必要な細胞株と試薬のセットです。生細胞cAMP アッセイ

本キットは、FLIPR®、FDSS®、または他の同等の蛍光マイクロプレートリーダーを用いて細胞内のcAMP変化を測定するために必要な細胞株と試薬のセットです。GsやGi共役GPCR活性の測定に良好に使用されています。

Gタンパク質共役型受容体（GPCR）は最も大きな受容体クラスの一つであり、創薬研究の標的とされています。カルシウムフラックス（Gq経路を介して共役）アッセイは、創薬研究におけるGPCRターゲットのスクリーニングおいて好まれる手法です。しかし、60%以上の既知のGPCRがcAMPと共役したアデニル酸シクラーゼ活性を介して信号を送ります。現存のcAMPアッセイのほとんどは、細胞の可溶化が必要なだけでなく、時間的かつ空間的解像度に欠けています。

Screen Quest™ Live Cell cAMP Assay Service Packでは、細胞の可溶化を行うことなく、ハイスループット形式で細胞内cAMP変化をリアルタイムでモニタリングできます。このアッセイは、外来性環状ヌクレオチド感受性チャネル（CNGC）またはGα16（乱交雑なGタンパク質）の何れかをもつ細胞株*を介して機能します。前者のチャネルは、細胞内cAMPレベルの上昇により活性化され、イオンフラックスと細胞膜脱分極が生ずるため、これを蛍光カルシウム指示薬*（例えばCalbryte™ 520 AM、Cal-520® AM、およびFluo-8® AM）または蛍光膜電位色素によって検出します。Gα16を特定の非Gq共役受容体と共発現すると、受容体刺激を受けて細胞内カルシウムシグナルが産生します。後者の細胞株は、Gα16（乱交雑なGタンパク質）を含むGタンパク質キメラ系列をベースにしています。このキメラは、5カルボキシ末端のアミノ酸が他のGタンパク質の何れか（Gαs、Gαi、Gαo、またはGαzの何れか）のものと置換されたGqタンパク質複合体のαサブユニットから構成されています。これらのアミノ酸はそのGタンパク質への受容体の共役において主要な役割を担います。これらのキメラを通常はcAMP経路を介して作用する特異的な非Gq共役受容体と同時発現すると、受容体刺激を受けて細胞内カルシウムシグナルの産生が生ずる可能性があります。

GsやGi共役GPCR活性の測定に

図.1 Screen Quest™ Live Cell cAMP Assayの原理

 以下の細胞株、アッセイキットより組み合わせてお選び下さい

図.2 CHO-Ga16-NOP細胞におけるノシセプチン刺激性カルシウム応答をCal-520® AM (Cat#21130) を用いて測定した。
CHO-Ga16-NOP細胞を96穴の黒壁/澄明底コースタープレートの各ウェルに60,000細胞/100 µLずつ播種して一晩培養した。20 mM へペス緩衝液 (HHBS)を含むHanks緩衝液に溶解した10 µM Cal-520® AMに2mMプロベネシドを添加した100 µLの溶液で細胞を37℃で1時間培養した。その後、Cal-520® AM導入溶液をHHBSと1 mMプロベネシドで置換した。ノシセプチンをFlexStation® (Molecular Devices)で記載した最終濃度に達するまで添加した。

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それぞれ単品でもご購入可能です。

• カルシウム指示薬
• AAT Bioquest社　細胞代謝とシグナリングアッセイ

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